IncN1和IncFIB多重耐药质粒的测序及结构基因组学分析

发布时间：2020-09-07 12:05

　　随着抗生素的滥用,多重耐药菌株逐渐增多,严重影响感染性疾病的治疗。细菌染色体上的耐药基因可以在很多种类的移动元件的作用下整合到质粒上,而质粒可以通过细菌间性菌毛的接触在不同菌种间进行传播。故明确多重耐药质粒中耐药基因、移动元件,阐明耐药分子遗传特征十分重要。本文针对临床分离的多重耐药菌株,对质粒介导多重耐药的机制进行探索研究,具体分为两个部分:(1)含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他携带bla_(NDM)的IncN1型质粒的结构基因组学分析;(2)IncFIB家族多重耐药质粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tetA的测序和比较基因组学分析。含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他携带bla_(NDM)的IncN1型质粒的结构基因组学分析大肠杆菌BTR于2013年分离自北京同仁医院一名患者的尿液样本。通过VITEK-2自动系统和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。对主要的ESBLs基因、碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、大环内酯类耐药基因和常见的四环素耐药基因进行PCR筛查。使用七个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)进行多位点序列分型。进行质粒接合转移实验。为了验证bla_(NDM-1)在相关菌株中是否表达,通过改良Carba NP法检测菌株是否产碳青霉烯酶及其类型。通过微量肉汤稀释法检测药物敏感性。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取细菌基因组,使用“鸟枪法”构建全基因组文库,并在Ion PGM测序平台上进行高通量测序。通过多位点序列分型,大肠杆菌BTR属于序列型405,并且通过PCR筛查检测到bla_(NDM-1)、bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、qnrS1、qnrD、erm(B)和mph(A)耐药基因的存在。bla_(NDM-1)和qnrS1基因可以通过接合转移方式从菌株BTR共转移到大肠杆菌EC600,产生接合子BTR-NDM-EC600,证明这两个耐药基因位于同一个质粒上,该质粒被命名为pNDM-BTR。菌株BTR和接合子BTR-NDM-EC600都产B类碳青霉烯酶,并且都对氨苄西林、头孢唑林、头孢呋新、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、美罗培南、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲恶唑和环丙沙星耐药,但都对替加环素、呋喃妥因、磷霉素和多粘菌素敏感。此外,菌株BTR还对氨曲南、氯霉素、阿奇霉素、庆大霉素和四环素耐药。本部分研究共纳入分析6个质粒,即IncN1型质粒的参考质粒R46、所有全测序且携带bla_(NDM)的IncN1型质粒(p LK78、p LK75、pEcNDM1和pNDM-BTR)以及与pNDM-BTR具有最高覆盖度和一致性的近源质粒pMR3-OXA181。每一个质粒的结构都可以分为保守的IncN1型骨架区和一些外源插入区。保守的IncN1型骨架区包括了repA和它的iterons、stbABC orfD操纵子、保守上游重复控制调节子区以及kikA、resP、korB和tra基因。在六个质粒骨架区不同位点整合了很多外源插入区。R46包括一个多重耐药区,其由1型整合子In1、ΔTn6309、砷抗性座位arsRDABC orf378、orf657和IS26组成。质粒p LK78、pLK75、pEcNDM1和pMR3-OXA181均包括了两个外源插入区:pLK78包括Tn1721残余和一个由1型整合子In1021、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2组成的多重耐药区;pLK75包括In1021-5’和一个由IS1X2、ecoRII ecoRIImet、In1021-3’和Tn1721残余组成的多重耐药区;pEcNDM1包括Tn1721残余和一个由1型整合子In1007、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2组成的多重耐药区;pMR3-OXA181包括Tn3家族新的转座子Tn6361和由1型整合子In191、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2组成的dfrA14区。pNDM-BTR包括三个外源插入区,即IS26、dfrA14区和Tn3家族新的转座子Tn6360。本部分研究为耐药基因在IncN1型质粒间通过移动元件进行水平转移、IncN1型质粒的多样化和进化(特别是携带bla_(NDM)基因的IncN1型质粒)提供了更深入的理解,对携带bla_(NDM)基因的IncN1型质粒的流行病学研究提供了理论依据。IncFIB家族多重耐药质粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tet A的测序和比较基因组学分析肺炎克雷伯菌A1705于2013年分离自沈阳盛京医院一名患者的尿液样本。肺炎克雷伯菌911021于2014年分离自重庆医科大学第一附属医院一名患者的尿液样本。肺炎克雷伯菌1642于2014年分离自北京307医院一名患者的肺泡灌洗液。通过VITEK-2自动系统和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。对主要的ESBLs基因、碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、大环内酯类耐药基因和常见的四环素耐药基因进行PCR筛查。使用七个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)进行多位点序列分型。使用QIAGEN Plasmid Midi Kit试剂盒提取质粒,进行质粒电转化实验。通过VITEK-2自动系统检测药物敏感性。使用Qiagen BloodCell Culture DNA Maxi Kit提取细菌基因组DNA。针对菌株1642,构建了平均长度为5k的Nextera Mate Pair大片段文库,并在Illumina MiSeq测序平台上进行高通量测序。针对菌株A1705和911021,在基于单分子实时测序技术的PacBio RSII测序平台上进行测序。通过多位点序列分型,表明菌株A1705和911021分别属于序列型449和11,而菌株1642代表了一个新的序列型2040。通过PCR筛查,表明肺炎克雷伯菌A1705携带bla_(KPC-2)、bla_(NDM-1)、bla_(OXA-1)、qnrS1、oqxAB、tetA(A)、tetA(D)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)、bla_(TEM-1)和bla_(SHV-33)耐药基因;肺炎克雷伯菌911021携带bla_(KPC-2)、qnrS1、oqxAB、mph(A)、tetA(A)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-11)和bla_(TEM-1)耐药基因;肺炎克雷伯菌1642携带bla_(KPC-2)、qnrS1、mph(A)、tetA(A)、bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-12)和bla_(CTX-M-14)耐药基因。菌株A1705、911021和1642中的qnrS1、tetA(A)和bla_(CTXM-14)基因均可以通过电转化方式共转移到大肠杆菌DH5α,产生电转子A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α,证明这些耐药基因分别位于同一个质粒上,质粒被分别命名为pA1705-qnrS、911021-tetA和1642-tetA。菌株A1705、911021和1642及其各自的电转子,即A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α都对氨苄西林、复方新诺明、哌拉西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢曲松和庆大霉素耐药,菌株A1705、911021和1642还对头孢替坦、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、呋喃妥因耐药。此外,菌株911021和1642对阿米卡星耐药,但是菌株A1705对阿米卡星敏感。本部分研究中共纳入分析8个质粒,即参考质粒pKPN-c22(首次完整测序的含有基因repA和repB1的质粒)、pA1705-qnrS、p911021-tetA、p1642-tetA以及携带基因repA和rep B1且和各质粒具有最高覆盖度和一致性的四个的质粒,即pKPN3-307_typeA、pKPN3-307_TypeC、p6234-198.371kb和pKPSH11。每一个质粒的结构都可以分为骨架区和大量的外源插入区。主要的骨架区基因包括repA和repB1、umuCD、parAB以及parB的附着位点parC、finO和一系列F型接合转移基因,包括rlx、dtr、cpl、sfx、eex、tivF(tivF1到tivF16、tivF18和tivF19)、traJQ和trbEF。在八个质粒骨架区不同位点存在许多不同的外源插入区,尤其是在骨架区orf312和repB1之间存在一个巨大的外源插入区。该外源插入区内包括了一个或两个多重耐药区。质粒pKPN-c22、pKPSH11、p6234-198.371kb、pKPN3-307_TypeC、pKPN3-307_typeA、p911021-tetA和p1642-tetA都含有一个多重耐药区,而质粒pA1705-qnrS含有两个多重耐药区。各质粒的多重耐药区又由很多的移动元件组成,比如插入序列、整合子、转座子和转座单元。本部分研究为耐药基因在Inc FIB家族质粒间通过移动元件进行水平转移提供了更深入的理解。此外,为临床多重耐药肠杆菌科细菌,特别是多重耐药肺炎克雷伯菌的传播提供研究依据。总结本研究分别对两类多重耐药质粒进行了系统且全面的描述,包括复制起始基因、骨架区和外源插入区,耐药基因和移动元件,从而阐明了由多重耐药质粒介导的耐药机制,可为多重耐药菌的研究与防控提供理论支持。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

电泳图,耐药基因,电泳图,底物

图 1.1 标记耐药基因电泳图Figure 1.1 PCR result of BTR and its related strains1.3.2.3 改良 Carba NP 法使用改良 Carba NP 法检测菌株是否产碳青霉烯酶及其类型，其中底物Ⅰ为阴性对照；底物Ⅱ为亚胺培南+硫酸锌；底物Ⅲ为亚胺培南+硫酸锌+他唑巴坦（他唑巴坦可抑制 A 类酶）；底物Ⅳ为亚胺培南+硫酸锌+EDTA（EDTA 可抑制 B 类酶）；底物Ⅴ为亚胺培南+硫酸锌+他唑巴坦+EDTA。如果底物Ⅲ中检测孔由红色变为橙黄色且底物Ⅴ中检测孔仍为红色，则为 B 类酶；如果底物Ⅳ中检测孔由红色变为橙黄色且底物Ⅴ中检测孔仍为红色，则为 A 类酶；如果底物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中检测孔均由红色变为橙黄色，则可能为 D 类酶（可能为 D 或者 A+D 或者 B+D 或者A+B+D，不可区分），具体实验结果见图 1.2：

IncN1和IncFIB多重耐药质粒的测序及结构基因组学分析

改良CarbaNP法结果

全序,圈图,质粒,内环

第 25 页图 1.3 质粒全序圈图Figure 1.3 Plasmid schematic maps：图中，最内环表示 GC 偏移量；次内环表示 GC 含量；最外环表示基因且按功能分颜色表示；次外环中灰色部分表示质粒骨架区，黑色区表示外源插入区。

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