Nrf2信号通路在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究

发布时间：2020-09-24 05:04

　　第一部分:靶向激活Nrf2信号通路在a GVHD中的作用研究目的:研究激活Nrf2信号通路在a GVHD发生发展中的作用。方法:建立小鼠同基因造血干细胞移植(sys-HSCT)和异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后小鼠a GVHD模型,在移植后7天获取小鼠靶器官脾脏、肝脏、肺脏和小肠组织,抽提RNA,采用荧光定量PCR法检测各靶器官中的Nrf2的表达水平,比较同基因/异基因HSCT对Nrf2的影响。采用C57BL/6(H-2b)小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,采用辐照的BALB/c(H-2d)小鼠骨髓来源DCs作为刺激细胞,体外建立混合淋巴细胞反应体系,通过加入不同浓度的Nrf2激动剂富马酸二甲酯(DMF),采用~~3H-Td R掺入法、CFSE标记法和ANNEXINV/PI法,检测T细胞的增殖、凋亡情况。ELISA检测上清中细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。研究DMF激活Nrf2后对异基因反应性T细胞增殖、凋亡和活化的影响。体外采用anti-CD3/CD28刺激T细胞活化,然后加入不同浓度的DMF,采用~3H-Td R掺入法研究DMF对非特异性T细胞激活后的增殖情况。体外采用GM-CSF联合IL-4法从小鼠骨髓中诱导DCs,然后加入不同浓度的DMF或LPS,流式检测DCs表面CD80、CD86和CD40的表达水平,ELISA检测上清中IL-6和IFN-γ和TNF-α的水平,研究DMF对DCs活化和成熟的影响。采用C57BL/6(H-2~b)小鼠作为供体,采用BALB/c(H-2~d)小鼠作为受体。受体小鼠接受清髓性预处理(全身照射8.5Gy),通过输注1×10~7骨髓细胞+5×10~6脾脏细胞建立小鼠a GVHD模型。于预处理前3天予DMF灌胃(30mg/kg/d),连续给药7天。移植后每天两次观察小鼠生存状态,每3天进行a GVHD临床评估。4周后收集小鼠肝脏、肺、肠和皮肤行HE染色并进行病理组织学分析。研究体内激活Nrf2后对小鼠a GVHD的影响。结果:(1)荧光定量PCR结果显示,和syn-HSCT相比,allo-HSCT 7天后小鼠靶器官脾脏、肝脏、肺脏和小肠组织中的Nrf2的表达水平显著降低,提示allo-HSCT后小鼠Nrf2抗氧化通路明显下调,该通路的减弱提示allo-HSCT小鼠体内氧化应激活性增高。(2)体外混合淋巴细胞反应结果表明,DMF能够以剂量依赖的方式抑制同种异基因反应性T细胞的增殖,CFSE标记实验表明CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖均受到明显抑制;此外,细胞培养上清中的炎症因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α也呈显著降低,且呈剂量依赖性,表明DMF能够抑制异基因反应性T细胞的增殖和活化。细胞凋亡实验表明,DMF能够促进异基因反应性CD4+T细胞和CD8+T细胞的凋亡;更重要的是,发生凋亡的细胞主要是CFSE~(low)的一群具有高增殖活性的细胞群体。(3)体外使用CD3/CD28刺激T细胞的实验表明,DMF也能够直接以剂量依赖的方式抑制T细胞的增殖。(4)DMF对DCs的成熟没有明显的促进作用,但是当DCs预先被LPS活化后,DMF能够以剂量依赖的方式抑制DCs表面CD80,CD86和CD40的表达,同时还能抑制IL-6和TNF-α等细胞因子的分泌,表明DMF对已经成熟DCs的活化具有抑制作用。(5)动物实验表明,在移植后早期应该DMF干预能够显著延长a GVHD小鼠的生存,减轻a GVHD的症状,HE病理分析也表明DMF干预后组受鼠的a GVHD靶器官肝,肺,肠和皮肤的病理损害较对照组显著减轻,表明DMF能够改善小鼠的a GVHD症状,抑制a GVHD的发生发展。结论:allo-HSCT后小鼠Nrf2抗氧化通路明显下调,使用DMF激活Nrf2能够抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌,抑制DCs的活化和IL-6和TNF-α的表达。体内使用DMF干预可以显著延长a GVHD小鼠的生存,减轻a GVHD的症状,抑制a GVHD的发生发展。第二部分:靶向激活Nrf2信号通路减弱a GVHD的机制研究目的:研究靶向激活Nrf2信号通路减弱小鼠a GVHD的免疫学机制。方法:分离allo-HSCT后14天的DMF干预组和对照组受体小鼠脾脏细胞,和经照射的BALB/c小鼠脾细胞进行共同培养,建立Ex-Vivo的混合淋巴细胞反应,通过~3H-Td R检测细胞增殖情况。采用流式细胞术检测移植后14d时DMF干预组和对照组小鼠脾脏中的CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞,活化的CD4(CD4+CD69+)、CD8细胞(CD8+CD69+)的比例,体外使用PMA/Ionomycin/BFA激活检测CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌细胞因子IFN-γ的情况,采用ELISA法检测移植后14d两组小鼠血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。采用磁珠法分选小鼠脾脏中的CD3+T细胞,体外采用anti-CD3/CD28抗体激活T细胞,然后使用不同浓度的DMF处理,24h后检测T细胞活化分子CD69、CD25、CD44以及PD-1的表达水平,研究DMF对T细胞体外活化的影响。采用活性氧Reactive Oxygen Species Assay Kit检测试剂盒,检测DMF处理后T细胞中ROS的表达水平,研究DMF对T细胞氧化水平的影响。抽提移植后14d两组小鼠脾脏RNA,逆转录成c DNA,采用荧光定量PCR法检测抗氧化通路分子Nrf2,keap 1以及抗氧化防御酶HO-1和GST-α1的m RNA表达水平。采用免疫荧光法检测DMF处理后T细胞内Nrf2的入核情况。结果:(1)Ex-Vivo混合淋巴细胞实验表明,DMF能够显著抑制体内异基因反应性T细胞的增殖。(2)流式细胞术检测表明,移植后14d时,和对照组相比,DMF干预组小鼠脾脏中的CD3+T、CD4+T细胞的百分比显著降低,而CD8+T细胞则明显升高。DMF干预的受体小鼠的CD4+T和CD8+T细胞的活化明显降低,其表面CD69的表达显著减少,表明DMF可以减少a GVHD小鼠脾脏中的T细胞浸润和活化,减轻a GVHD的异基因免疫应答。(3)体外T细胞活化实验表明,DMF能够以剂量依赖的方式抑制T细胞活化,下调表面CD69,CD44以及PD-1的表达水平,但是却轻微上调CD25的水平。(4)通过细胞内染色检测移植后14天的受体小鼠的CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平。结果显示,DMF组受体小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细分泌IFN-γ水平显著降低,与此一致的是,血清中炎症因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平在DMF组也显著降低,表明DMF能够抑制Th1细胞的免疫应答,进而减轻a GVHD。(5)用活性氧检测试剂盒检测活化的T细胞中ROS水平,结果表明DMF可以以剂量依赖的方式抑制活化的T细胞中ROS水平;此外,通过q RT-PCR检测受体鼠脾脏中Nrf2,keap1和抗氧化防御酶HO-1和GST-α1的m RNA表达。结果显示,DMF组受体小鼠脾脏中Nrf2水平、HO-1和GST-α1的表达均显著上调,表明DMF能够促进抗氧化反应,抑制小鼠体内的氧化应激的水平。进一步通过免疫荧光实验证实,DMF能够促进T细胞内Nrf2的入核,Nrf2入核是其发挥抗氧化应激的主要机制。结论:DMF能够抑制供体T细胞同种异基因反应性以及促炎症细胞因子的分泌,上调抗氧化酶,减轻a GVHD。第三部分:靶向激活Nrf2信号通路促进Treg细胞分化发育目的:研究靶向激活Nrf2信号通路在Treg细胞分化发育中的作用,以及研究DMF减弱a GVHD是否是Treg细胞介导的。方法:采用流式细胞术检测移植后14d时DMF干预组和对照组小鼠脾脏中的Treg细胞的水平,观察DMF干预对小鼠Treg细胞的影响。通过磁珠分选小鼠CD4+T细胞,体外通过TGF-β和IL-2刺激建立Treg细胞诱导分化体系,通过给予不同浓度的DMF干预4d,研究DMF对Treg细胞体外分化的影响。采用BALB/c(H-2~d)小鼠作为受体。受体小鼠接受清髓性预处理(全身照射8.5Gy),通过输注5×10~6去除T细胞的骨髓细胞+1×10~6纯化的T细胞或者CD25-的T细胞,然后给予DMF干预处理,观察体内去除Treg细胞后,DMF对a GVHD的抑制作用是否仍然存在。ELISA检测移植后14d时小鼠血清中TGF-β的水平。建立体外混合淋巴细胞反应,加入不同浓度的DMF,3d后检测细胞培养上清中TGF-β的水平,研究DMF促进Treg分化的机制。结果:(1)流式细胞术检测发现和对照组相比,DMF组小鼠脾脏中Treg细胞的比例及绝对值明显增加,表明DMF在体内可以增加Treg细胞的数目。(2)体外Treg诱导分化实验表明DMF对Treg细胞的体外分化呈剂量依赖性促进作用。(3)为了进一步证实DMF对a GVHD的影响是通过促进Treg细胞来实现,我们将供者T细胞中的Treg细胞剔除,然后建立a GVHD模型并给予DMF干预处理,结果发现体内清除Treg细胞后,DMF组保护a GVHD的作用被减弱了,小鼠的生存显著低于DMF+不清除Treg细胞组。而在对照组中剔除Treg细胞,则不影响小鼠的a GVHD生存,表明DMF减弱a GVHD是通过Treg细胞介导的,剔除Treg细胞后DMF保护a GVHD的作用便减弱甚至消失了。(4)TGF-β是诱导Treg分化发育的最主要细胞因子,我们检测了a GVHD小鼠体内TGF-β和体外MLR体系中的TGF-β水平,结果表明DMF能够促进小鼠脾脏TGF-β的水平,体外呈剂量依赖性的促进TGF-β的分泌,表明DMF诱导Treg细胞分化主要是通过诱导TGF-β的表达来实现的。结论:靶向激活Nrf2信号通路减弱a GVHD是Treg细胞依赖的,体内剔除Treg细胞后DMF保护a GVHD的作用被明显减弱,DMF能够通过促进TGF-β的表达诱导Treg细胞的分化发育。第四部分:靶向激活Nrf2信号通路在GVL中的作用及机制研究目的:研究靶向激活Nrf2信号通路在allo-HSCT后移植物抗白血病(GVL)中的作用及机制。方法:采用C57BL/6(H-2~b)小鼠作为供体,采用BALB/c(H-2~d)小鼠作为受体。受体小鼠接受清髓性预处理(全身照射8.5Gy),通过输注1×107骨髓细胞+5×10~6脾脏细胞+1×10~6个带luciferase的A20细胞建立小鼠a GVHD/GVL模型。于预处理前3天予DMF灌胃(30mg/kg),连续给药7天。移植后每天两次观察小鼠生存状态,每3天进行a GVHD临床评估。移植后每周在小动物活体成像仪上实时观测小鼠体内的肿瘤负荷。将移植后两周的小鼠的脾脏细胞作为效应细胞,A20细胞作为靶细胞,采用Promega Cyto Tox96非放射性细胞毒检测试剂盒检测DMF作用后效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。采用CCK-8法检测DMF对A20细胞增殖和凋亡的影响。结果:(1)为了评估DMF对GVL效应的影响,a GVHD小鼠在异基因造血干细胞移植后用A20-luc白血病细胞攻击。结果表明只接受骨髓细胞加A20-luc白血病细胞移植的小鼠中,DMF组和对照组在移植后40天内全部死亡,两组生存没有显著差异,表明在没有T细胞的情况下,DMF不能发挥GVL效应,DMF在体内对肿瘤细胞的增殖没有没有抑制作用。但是当接受异体骨髓和脾细胞的移植小鼠加上A20-luc后再给予DMF,则能够显著延长小鼠的生存,小动物活体成像表明DMF干预组的肿瘤负荷更低,提示GVL效应得到保留,DMF能够通过增强T细胞功能发挥GVL效应。(2)体外细胞增殖实验表明低浓度的DMF对A20细胞的增殖和没有直接抑制作用,对细胞的凋亡也没有明显的促进作用。此外,细胞杀伤实验显示经DMF干预的受者小鼠的供体T细胞显示出更强的针对A20白血病细胞的CTL杀伤活性,表明DMF可以保持异基因造血干细胞移植后GVL效应。结论:DMF在抑制a GVHD的同时能够保留GVL效应,DMF对肿瘤细胞的增殖和凋亡没有直接作用,但是能够促进供体T细胞的细胞杀伤活性,从而发挥抗白血病效应。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R457.7
【部分图文】：

异基因造血干细胞移植,急性移植物抗宿主病,移植物抗宿主病,皮质类固醇

Nrf2 信号通路在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究引言引言异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）已成为治疗恶性血液系统肿瘤的最有效手段，allo-HSCT中供者来源的异基因反应性T细胞在发挥抗白血病效应（GVL）的同时，也会为受者带来移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）的危险。因此如何有效平衡allo-HSCT后急性GVHD（acute GVHD，aGVHD）和GVL是提高移植疗效的关键和难点所在[1]。目前aGVHD的治疗主要依赖于皮质类固醇及环孢素类免疫抑制剂，其功效有限却有相当大的毒性，部分患者仍然会发生严重的aGVHD，严重影响患者移植后生活质量[1]。因此，寻找既能有效控制aGVHD发病率及严重程度，又能较好维持GVL效应的治疗方案是当前异基因造血干细胞移植的热点和难点问题。

急性移植物抗宿主病,炎性因子,穿孔素,反组

言 Nrf2 信号通路在急性移植物抗宿主病中的作用及机肤等，通过 Fas/FasL、穿孔素、颗粒酶B以及释放大量促炎细胞因子如IL-2、IFF-α，构成细胞因子风暴，攻击受者靶细胞从而形成aGVHD病理损伤。移植前预处理损伤诱导产生的大量活性氧自由基（ROS），能导致氧化应激反组织细胞凋亡和坏死，诱发组织炎症，是靶器官损伤的重要因素（图2）[3阻断早期的免疫启动阶段，减轻预处理导致的组织损伤，降低炎性因子水平抑制aGVHD发生，减轻aGVHD进展的有效策略。

生理学,来源

图 3. ROS 来源及生理学作用。（Biochem J. 2011;435(3):545-51）核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2）是机体抗氧化的中枢调控因子[6]。Nrf2于1994年被鉴定为编码转录激活剂的cDNA克隆，n-collar (CNC)家族，是携带有亮氨酸拉链结构的转录因子[7]。生理状态下胞质中与 Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白（ Kelch-like ECH-assoin-1,Keap1）结合而被降解，不发挥生理作用。当机体处于氧化应激状态或

【参考文献】