益生菌制剂改善脓毒症小鼠生存情况及肠道微生态的研究

发布时间：2020-10-17 08:25

　　 目的探讨益生菌改善脓毒症小鼠生存情况及肠道微生态的可能机制。方法本研究将60只4周龄的雄性C57BL6小鼠随机分为三组,分别为:益生菌+脓毒症组(Probiotics+ Septic 20只),对照脓毒症组(Control Septic 20只)和假手术组(Sham20只)。益生菌+脓毒症组每天给予200叫益生菌(BIFICO,含长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌活菌数不低于1.0×107CRJ)溶液,对照脓毒症组与假手术组每天给予200μl生理盐水连续灌胃4周。随后予两组脓毒症组小鼠盲肠结扎穿孔手术(Cecal Ligation and Puncture CLP),空白对照组予假手术。每组10只用于观察小鼠活动状态及7天生存数量。剩余每组10只,术后24时取血液、结肠组织、肠内粪便;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定每组血清中炎症因子IL-22、IL-2、TNF-α含量;通过HE染色法观察结肠组织形态,使用抗紧密连接相关蛋白(Occludin)免疫组化观察肠粘膜Occludin的表达;随机抽取每组5份粪便样本,分别提取小鼠粪便DNA,通过16SrDNA高通量测序技术分析肠道微生态多样性,鉴定与比较不同处理组小鼠肠道菌群的组成及丰度差异。实验数据以均数±标准差来表示,采用单因素方差分析(OnewayANOVA)进行分析,Boferroni检验或Tamhane’s T2检验进行多重假设检验校正。生存分析采用log-rank检验Kaplan-Meier 生存曲线。结果CLP术后第5天,Control Septic组剩余0只。Probiotics+ Septic组还剩余5只,直到术后第7天,仍有3只存活,予安乐死。Probiotics+ Septic的7天生存数量显著高于Control Septic(P=0.042)。3种炎症因子在Control Septic中均升高,益生菌早期干预后,IL-22、IL-2水平虽然仍高于Sham(P0.001),但较Control Septic组显著降低(P0.001),提示益生菌有助于降低机体炎症反应。而TNF-α在两组脓毒症组血清中均高于Sham组(P0.001),提示预先给予益生菌无法降低脓毒症小鼠TNF-α。Probiotics+ Septic组和Sham组小鼠结肠粘膜未出现明显结构损伤,但Control Septic组小鼠结肠黏膜结构有较大损伤。Occludin蛋白在Control Septic组小鼠的结肠上皮细胞内表达低于Sham组小鼠,但在Probiotics+ Septic组中Occludin蛋白的表达则高于Control Septic组小鼠。高通量测序提示Control Septic组中拟杆菌门(Bacteroide)显著增加(P0.001),厚壁菌门(Firmicutes)显著减少(P0.001),Probiotics+Septic组与Sham组接近,无统计学差异。两组脓毒症组中变形菌门(Proteobactria)丰度接近,无统计学差异,与Sham组比较,其丰度显著增加(P0.001)。在科水平上,Control Septic 组中拟杆菌门 S24-7 科(P-Bacteroide F-S24-7)显著增加(P0.001),厚壁菌门梭菌目(P-FirmicutesO-Clostridiales)显著减少(Probiotics+ Septic 组 vs Control Septic 组 Pp-c=0.006;Control Septic 组 vs Sham组Pc-s=0.048),Probiotics+Septic组与Sham组在上诉两种菌科水平丰度均接近,无统计学差异。两组脓毒症组中变形菌门螺杆菌科(P-Proteobacteria F-Helicobacteraceae)接近,无统计学差异,较 Sham 组显著增加(Probiotics+Septic组 vs Control Septic 组 Pp-s0.001;Pc-s0.001);Probiotics+ Septic 组中变形菌门脱硫弧菌科(F-Desulfovibrionaceae)较 Control Septic 组显著降低(P=0.021),Sham组位于两者间,无统计学差异。预先给予益生菌可稳定脓毒症小鼠肠道菌群结构,却无益于有害菌的减少。结论预先给予益生菌可稳定脓毒症小鼠肠道菌群结构,减轻有害菌的毒力作用,抑制炎症因子的释放,从而维持肠道黏膜屏障结构和功能,减少肠上皮细胞间紧密连接蛋白损失,抑制肠道屏障渗透,改善脓毒症小鼠生存情况。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋?Ｓｅｐｔｉｃ组还剩余５只，直到术后第７天，仍有３只存活，予安乐死。??Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋?Ｓｅｐｔｉｃ?的?７?天生存数量显著高于?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?组小鼠（Ｐ＝０．０４２）。１０??只Ｓｈａｍ小鼠全部存活（图１）。??１５０１?一?Ｓｈａｍ（ｎ＝１０）??＿?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?（ｎ＝１０）??＊?？！〇〇?，??，?－１－?Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋Ｓｅｐｔｉｃ（ｎ＝?１０）??＝?—￣?十?ｒ??ｖ）?丄?ｉ??１??芒?广－?Ｔ??ａ?５０－?１?——Ｉ??ｌ?丄??—＊?Ｊ－??０?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ??０?２?４?６?８??Ｄａｙ??图１?ＣＬＰ术后小鼠７天生存数量。Ｓｈａｍ小鼠，ｎ＝?１０；?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ，?ｎ＝?１０；??Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ?＋?Ｓｅｐｔｉｃ，?ｎ?＝?１０（Ｐ＝０．０４２）；术后第?３?天，Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?组小鼠只剩?４?只??存活，Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋?Ｓｅｐｔｉｃ?组剩?８?只。术后第?５?天，Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?组剩佘?０?只。Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋??Ｓｅｐｔｉｃ组还剩余５只

２．２益生菌与脓毒症小鼠血清炎症因子的关系??为了检测益生菌对脓毒症小鼠血清炎症因子水平的影响，我们用Ｅｌｉｓａ法分别??检测了?ＩＬ－２２、ＩＬ－２、ＴＮＦ－ａ在３组小鼠血清中的含量（表１）（图２）。肿瘤坏死因??子ａ?（ＴＯＦ－ａ）是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与??正常炎症反应和免疫反应。ＴＮＦ－ｃｔ在包括败血症的许多病理状态下产生增多。??１１＾２，又名丁细胞生长因子（１＇〇６１啦〇＼＾１１￡３以〇１＇，１＇００〇，主要由活化的＃埃矗?保?福崳?胞和ＣＤ８＋Ｔ细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。是所有Ｔ细胞亚群的生长??因子，并可促进活化Ｂ细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子。ＴＮＦ－ａ与ＩＬ－２??可促进炎症反应的发生，引起肠黏膜屏障功能损伤，另外ＴＮＦ－ａ还可引起不依赖??细胞凋亡的肠黏膜屏障的通透性的增加［２４］。细胞因子ＩＬ－２２在急性炎症期参与微生??物防御，保护和修复组织损伤，但也能够延长宿主细菌清除时间，故其在脓毒症??发展中有双重免疫调节作用［３］。我们通过实验发现，３种炎症因子在ＣｏｎｔｒｏｌＳｅｐｔｉｃ??中均升高，益生菌早期干预后，ＩＬ－２２、ＩＬ－２水平虽然仍高于Ｓｈａｍ（Ｐ＜０．００１），但较??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ组显著降低（Ｐ＜０．００１）

?正文结果??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ小鼠有所减轻（图３右）。三组小鼠的结肠在上皮完整度、腺体排列??整齐度及炎性细胞浸润程度上存在明显差别。以上结果提示，脓毒症严重破坏结??肠粘膜，而益生菌预处理能减轻脓毒症对小肠粘膜的破坏作用。??ＷＷＶ??戀仏＇：＇??图３益生菌预处理减轻结肠粘膜损伤。左：Ｓｈａｍ小鼠，结肠粘膜上皮完整，腺??体排列规则，少许或无炎症细胞浸润；中：Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ，结肠黏膜上皮腺体排列??紊乱、变形、缺失，肠上皮细胞间紧密连接结构模糊，炎症细胞广泛浸润，可见??隐窝脓肿形成；右：Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋Ｓｅｐｔｉｃ结肠上皮基本完整，未见糜烂缺失，腺体排??列基本正常，炎症细胞浸润程较少。（上排：ＨＥ＞＜５０，下排：ＨＥｘｌＯＯ）??２．４益生菌增加脓毒症小鼠肠粘膜紧密连接蛋白Ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表迗??为了进一步了解益生菌对脓毒症小鼠肠壁屏障功能的影响
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本文编号：2844535