基于纸基芯片的生物分子超敏识别技术研究

发布时间：2020-10-18 17:14

　　 背景:生物分子包含生物体内的蛋白、核酸、糖类等大、小分子物质,作为生物体内主要的活性成分,其在促进新陈代谢、维持供能、促进生长发育、传递遗传信息、产生免疫等方面起着重要作用。其中蛋白、核酸类生物标志物的有无或丰度高低对于疾病的预防、早期诊断、治疗监控具有重要意义。目前,常规的生物分子检测技术有免疫学检测技术和分子生物学检测技术。两类方法虽然在临床上得以广泛应用,但因其耗时、操作复杂,依赖特殊的仪器设备,不适用于临床快速、便携、POCT的需求,极大的限制了生物分子在临床诊断中的应用价值。因此,寻找一种快速、准确、便携、高灵敏、成本低廉的生物分子检测平台,对生物分子用于临床早期诊断、治疗以及生理状态监测具有重要意义。目的:以价格便宜、形状可控的纸基材料为基底,构建超敏的生物分子检测识别技术,实现蛋白类分子快速鉴定。通过对痕量核酸类分子准确定量,为生物分子检测提供一种全新的思路和方法。从根本上降低检测成本,简便操作过程,缩短响应时间,提高检测灵密度,实现仪器设备小型化、便携化,为复杂环境或贫困地区生物分子检测创造条件。方法与结果:本研究开发了基于纸基芯片检测生物分子的关键技术,实现了对蛋白和核酸的快速、高效检测。第一部分:基于染料显色的血型鉴定纸基芯片技术构建1.通过不同纸基材料孔径大小、结构排列的筛选,以及对全血层析情况对比,选用玻璃纤维膜作为层析垫和加样垫,棉浆纸作为抗体垫和反应垫进行血型纸基芯片的构建;进一步筛选出GF2型分离膜用于全血血浆分离,通过分离的血浆与相应试剂红细胞是否发生凝集,并结合溴甲酚绿(BCG)与血浆/全血反应颜色的不同判读血型结果。进一步为提高血型鉴定纸基芯片检测的效率,我们对红细胞抗原和抗体浓度进行优化,结果表明20%的试剂红细胞为最佳反定型抗原浓度,包被在纸基芯片上的抗A、抗B最适稀释浓度为1/32,抗D最适稀释浓度为1/64。2.以BCG与人血清白蛋白(HAS)特异性结合产生蓝绿色变化,BCG与全血反应产生褐色变化的特性,并结合检测特征光谱辅助判读结果,从而建立了以BCG作为显色剂的血型鉴定技术,同时该技术不受类血液颜色物质的干扰,极大提高检测的准确性和灵敏度。3.成功实现2min内无需离心的ABO正反定型同步血型检测,同时实现了30s内ABO正定型和ABD血型检测,本研究以纸基材料为基础建立的快速、便携血型鉴定芯片,为血型鉴定在极端条件下的应用提供了可能。第二部分:基于纸基石墨烯阵列芯片的核酸检测平台构建1.选用均匀、表面较为光滑的碳纸为基底,采用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)的方式垂直生长石墨烯阵列,最后通过电化学沉积AuNPs,构建出纸基石墨烯阵列芯片电极。其极大的增加了电极有效的比表面积,从而提升了探针在电极上包被的容量;此外,纸基芯片电极上的石墨烯阵列呈现为排列紧凑、分布均一的三维网络结构并垂直竖立在碳纸表面,增加了靶标miRNA与石墨烯阵列上固定的探针之间来回碰撞的频率,从而提高有效杂交的机会,保证检测的灵敏度。2.利用双链特异性核酸酶(DSN)实现信号放大,在靶标miRNA存在的条件下,电活性物质修饰的DNA探针和靶标miRNA形成双链DNA-miRNA复合物,DSN酶切降解DNA-miRNA复合体中的DNA,释放靶标miRNA,并重新与剩余的DNA探针杂交,开始新一轮酶切、释放和杂交过程,使大量DNA探针上的电活性物质脱离电极表面,导致电化学信号改变,实现将痕量miRNA检测转化成特征性的电化学响应信号输出。同时,利用DSN酶对核酸序列单碱基差异区分的能力,确保了纸基石墨烯阵列芯电极片对miRNA检测良好的特异性。3.所构建的纸基石墨烯阵列芯片传感器可实现对miRNA-155和miRNA-21并行同步检测,具有良好的线性响应。其线性范围为:100 aM-10 nM,线性方程分别为:Y=4.98logC+89.11和Y=5.69 logC+103.34,具有潜在的应用价值。结论:本研究中,基于纸基材料构建的生物分子检测芯片传感器,具有准确性高,响应速度快,便于携带,检测成本低的特点,且其制作方法简单、成本低廉,易于大批量生产和大范围推广应用,在复杂环境下,特别是偏远地区或者贫困地区具有重要的应用价值和意义。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R440
【文章目录】：
缩略语表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 基于染料显色的血型鉴定纸基芯片技术构建
    2.1 材料与方法
    2.2 结果
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 基于纸基石墨烯阵列芯片的核酸检测平台构建
    3.1 材料与方法
    3.2 结果
    3.3 讨论
    3.4 小结
全文总结
参考文献
文献综述 纸基生物传感器在临床诊断领域的研究进展
    参考文献
攻读硕士学位期间的研究成果
致谢

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本文编号：2846579