LAMP和RealAmp技术检测四种细菌性生物战剂的研究

发布时间：2020-10-20 02:59

　　 目的:土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis,FT)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,BP)、布鲁氏菌(Brucella,Bru)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,YP)均具有高度致病性和传染性,是重要的生物战剂,对人类的健康、甚至生存,构成极大的威胁。本研究旨在建立一种快速、准确可靠及易于推广的检测技术,以防范和应对以上细菌可能造成的生物恐怖威胁。方法:本研究基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amp Jlification,Real Amp),分别建立并优化本研究中所涉及细菌的检测体系。针对Fop A基因设计LAMP引物,检测土拉弗朗西斯氏菌;针对Fli C基因设计LAMP引物,检测类鼻疽伯克霍尔德菌;针对Omp25基因设计LAMP引物,检测布鲁氏菌;针对F1基因设计LAMP引物,检测鼠疫耶尔森氏菌。以同源性较高的菌株基因组DNA作为模板,评价检测体系的特异性;采用目标菌的基因组DNA和质粒作为模板,评价检测体系的灵敏度。以质粒菌污染环境土壤制备模拟样本,评价检测体系在实际环境中的检出限和应用价值,并与行内认可的实时荧光定量PCR试剂进行平行比对检测实验,评价检测体系的准确度和检测率。结果:(1)筛选出土拉弗朗西斯氏菌FopA基因、类鼻疽伯克霍尔德菌Fli C基因、布鲁氏菌Omp25基因和鼠疫耶尔森氏菌F1基因分别建立了环介导等温扩增技术和实时荧光环介导等温扩增技术,并优化反应条件和体系;(2)以其他非目标菌菌株基因组DNA和蜱虫基因组总DNA为模板,未出现非特异性扩增;(3)以土拉弗朗西斯氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达4.9×10~2 cfu/m L和4.9×10~1 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达8 copies/μL和5 copies/μL;以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×103 cfu/m L和1×10~2 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×10~2 copies/μL和1×10~1 copies/μL;以布鲁氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×10~2 cfu/m L和1×10~1 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×10~1 copies/μL和8 copies/μL;以鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA为模板,LAMP和Real Amp技术的灵敏度分别可达1×104 cfu/m L和1×103 cfu/m L,以质粒为模板,其灵敏度分别可达1×10~1 copies/μL和8 copies/μL;(4)分别采用土拉弗朗西斯氏质粒菌、类鼻疽伯克霍尔德菌质粒菌、布鲁氏质粒菌和鼠疫耶尔森氏质粒菌污染环境土壤建立模拟样本,除了LAMP检测鼠疫耶尔森氏质粒菌的检出限为44 cfu/g外,LAMP和Real Amp对其他质粒菌的检出限均可达4.4 cfu/g;且与实时荧光定量PCR试剂平行对比检测含高、中、低浓度(4.4×10~1 cfu/g~4.4×108 cfu/g)共24份土壤模拟样本,结果与预期一致。结论:本研究建立的土拉弗朗西斯氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的环介导等温扩增技术,特异性强、灵敏度高,仪器简便、成本低廉,反应时间较短,1 h即可完成,易于基层的推广使用;而实时荧光环介导等温扩增技术灵敏度更,20~40min即可查看扩增结果,简便快速;两种检测技术与实时荧光定量PCR试剂平行对比检测模拟样本,准确率和检出率均能保持持平,有望为临床诊断、环境污染检测、应对生物恐怖威胁和维护公众安全等方面提供有效、可靠的快速检测手段。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R440
【部分图文】：

图 1.2 LAMP 原理Fig 1.2 The Principle of LAMPLAMP 技术在等温条件下高效的扩增靶基因，水浴锅即可满足实验条避了大型循环仪的使用，成本低廉，易于基层推广使用，无温度变化大大反应时间；LAMP 反应过程中以哑铃状结构作为反应的模板，含有多个扩位点，扩增效率大大提高；LAMP 技术对目标序列具有高度特异性，可归LAMP 反应的初始阶段由六个独立序列和后期由四个独立序列识别目标序合逆转录，LAMP 可实现 RNA 序列的高效扩增；LAMP 反应中，产生大酸镁衍生物，呈现白色沉淀，反应体系浑浊，可通过肉眼判断目的基因扩增也可使用价格低廉的实时浊度仪提高检测终点判定的准确性。LAMP 技术泛应用于对细菌、病毒、寄生虫的快速检测和动物胚胎性别鉴定等领域[71.6 实时荧光环介导等温扩增技术

3.1 电泳观察 LAMP 扩增产resis Observation of LAMP0 bp marker；1：阳性对照；扩增反应体系素优化下易失活，因此基于 Bs于 60 ℃，Bst DNA 聚合酶影响，因此，选取 59 ℃疽菌、布氏菌、鼠疫菌分 3.2A、B、C、D。

图 3.2 LAMP 体系温度优化Fig 3.2 Temperature optimization of LAMP system LAMP 扩增温度梯度：M：100 bp marker；1：59 ℃；2：61 ℃；3：62 ℃；；6：65 ℃；7：66 ℃；8：阴性对照；B 类鼻疽菌 LAMP 扩增温度梯度：M1：59 ℃；2：61 ℃；3：63 ℃；4：65 ℃；5：67 ℃；6：69 ℃；8：阴性LAMP 扩增温度梯度：M：100 bp marker；1：59 ℃；2：61 ℃；3：63 ℃；；6：69 ℃；7：71 ℃；8：阴性对照；D 鼠疫菌 LAMP 扩增温度梯度：M1：57 ℃；2：59 ℃；3：61 ℃；4：63 ℃；5：65 ℃；6：67 ℃；7：69 ℃ 体系引物对比例的单因素优化据实验结果图 3.3A、B、C、D 可知，土拉菌、类鼻疽菌、布氏菌 1:4～1:6 时扩增效率最高、鼠疫菌在引物对比例 1:4～1:8 时扩增
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本文编号：2848110