基于质谱技术的临床重要疾病代谢相关标志物的鉴定及应用研究
发布时间：2020-10-24 07:59
背景:临床上重要疾病的筛查,对于疾病的诊断、治疗和预防至关重要,常可以降低疾病后期治疗成本、改善预后,甚至避免危害的发生。通过特定的技术对疾病早期代谢或筛查标志物进行检测,实现对疾病的早期筛查和预防,已成为现代公共卫生服务的重要内容,例如新生儿遗传代谢性疾病筛查,是当前转化医学研究的重要方向。目的:本研究尝试利用质谱技术筛选临床常见疾病,血红蛋白病(Hemoglobinopathy)及前列腺癌(Prostate cancer,PCa)的代谢及筛查标志物,以期建立标志物快速、高通量及低成本检测的新方法,实现对血红蛋白病及PCa的早期筛查及预防。方法:(1)以液相色谱—串联质谱(LC-MS/MS)技术为基础,研究干滤纸血片(Dried blood spot,DBS)样本微量血红蛋白提取的新方法,借助胰酶裂解血红蛋白,对Hemoglobinopathy患者血红蛋白进行分析,筛选和鉴定α地中海贫血(Hb H)、β地中海贫血、异常血红蛋白病(Hb E)等多种类型血红蛋白病的标志肽段,研究建立基于LC-MS/MS技术系统、高效筛查血红蛋白病的新方法。(2)利用LC-MS/MS技术和气相质谱技术(GC-MS)对PCa患者血液、尿液中的氨基酸、酰基肉碱以及有机酸等110余种代谢物进行了分析,并结合对不同类型PCa细胞及药物处理后各系细胞培养液的分析,筛选肿瘤特异性的代谢产物,并评价其用于PCa筛查及预后的临床价值。结果:(1)本研究收集各类血红蛋白病临床样本1600余例,建立了干滤纸血片(Dried blood spot,DBS)样本微量血红蛋白提取方法,并筛选和鉴定出多种类型的α地中海贫血(Hb H)、β地中海贫血、异常血红蛋白病(Hb E)的标志肽段,利用质谱技术对标志肽段进行定性、定量分析,初步建立了基于LC-MS/MS技术筛查血红蛋白病的新方法,并完成对新方法的方法学评价及应用评估。(2)通过对55例PCa患者血液、尿液中代谢物的分析,筛选出多种氨基酸、酰基肉碱及有机酸类特异代谢产物,初步评价证实了这些异常代谢物用于PCa筛查及分型的临床价值,并最终用体外实验证实了异常代谢物的肿瘤源性,为进一步建立筛查或诊断方法提供了依据。结论:(1)本研究所建立的LC-MS/MS技术系统、高效筛查血红蛋白病新方法用于血红蛋白病、特别是地中海贫血筛查,灵敏度和特异性均高于98%,采样速度快(60秒/例),检测通量高,成本低廉。(2)本研究筛选出血液及尿液前列腺癌特异性的代谢产物,并进一步验证了所筛选异常代谢物的肿瘤特异性,初步揭示了PCa的代谢特征,为进一步探索PCa病理机制和治疗方法奠定了基础。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446
【部分图文】：
可利用 LC-MS/MS 实现对珠蛋白链的定性、定量分析。LC-MS/MS 用于血红蛋白病检测，其检查原理如下：珠蛋白基因突变引起 β 珠蛋白链合成缺陷，或是产出分子量（M）改变了的异常珠蛋白（异常血红病），或是造成珠蛋白链合成缺失或不足（地中海贫血）（图 1.1，图 1.2-MS/MS 可以将血红蛋白经蛋白酶消化后的肽段按质荷比的不同进行分离排成含质荷比和离子峰强度信息的质谱图，用以反映突变前后珠蛋白链合成量子质量的变化[16]；数据分析时，找出离子峰发生改变（消失、出现或信号改质荷比所代表的特定珠蛋白链或肽段，分析其组合、响应强度，确定血红蛋异体的类型；结合使用个性化合成的多肽同位素内标，可同时实现对正常血白、异常血红蛋白的定性定量分析，对疾病的类型做出判断。国际上有报道 LC-MS/MS 检测镰状细胞贫血症（Sickle cell disorders，SCD）[17]，而对于其见的血红蛋白病，如 地中海贫血、β 地中海贫血等，国内外尚无相关研究报
图 1.2 β 地中海贫血发病机制Fig 1.2 The pathogenesis of β thalassemia因此，第一部分拟研究：（1）适于规模化筛查的标本制备。一项好的疾方法要求取材容易，标本便于保存，可长距离运输。干血滤纸片标本仅需样即可制备，试验前处理简单，适应于疾病规模化筛查。（2）地中海贫血液中血红蛋白定性、定量分析标志物的筛选。珠蛋白链水解后产生众多肽须找到 链、β 链各自的特征肽段，并结合突变类型，从这些特征肽段中选响应最好的肽段，即标志性肽段。（3）LC-MS/MS 筛查地中海贫血采样方。（4）LC-MS/MS 筛查地中海贫血方法的临床效能评价。好的筛查方法应确鉴别患病与否的能力，在重复使用时应有高的可靠性，而且检测成本要低
图 1.5 链 T1(729.4m/z)肽段的 MRM 模式鉴定Fig 1.5 Identification of peptide T1 (729.4 m/z) from globin by MRM mode.6 血红蛋白病筛查指标设计（1）筛查指标设计原理运行构建好的 LC-MS/MS 采样方法，得到所检测标本的原始数据，即仪器物的响应值及相应的质荷比信息，原始数据，通过软件分析，转化为筛查指于临床决策。珠蛋白基因突变引起 a 或 β 珠蛋白链合成缺陷，或是产出分子量（M）改异常珠蛋白（异常血红蛋白病），或是造成珠蛋白链合成缺失或不足（地中）。实验时，珠蛋白链可以用完全酶解后的每个特征片段代表，如 β-T1 VHLTP
【参考文献】
本文编号：2854208
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446
【部分图文】：
可利用 LC-MS/MS 实现对珠蛋白链的定性、定量分析。LC-MS/MS 用于血红蛋白病检测，其检查原理如下：珠蛋白基因突变引起 β 珠蛋白链合成缺陷，或是产出分子量（M）改变了的异常珠蛋白（异常血红病），或是造成珠蛋白链合成缺失或不足（地中海贫血）（图 1.1，图 1.2-MS/MS 可以将血红蛋白经蛋白酶消化后的肽段按质荷比的不同进行分离排成含质荷比和离子峰强度信息的质谱图，用以反映突变前后珠蛋白链合成量子质量的变化[16]；数据分析时，找出离子峰发生改变（消失、出现或信号改质荷比所代表的特定珠蛋白链或肽段，分析其组合、响应强度，确定血红蛋异体的类型；结合使用个性化合成的多肽同位素内标，可同时实现对正常血白、异常血红蛋白的定性定量分析，对疾病的类型做出判断。国际上有报道 LC-MS/MS 检测镰状细胞贫血症（Sickle cell disorders，SCD）[17]，而对于其见的血红蛋白病，如 地中海贫血、β 地中海贫血等，国内外尚无相关研究报
图 1.2 β 地中海贫血发病机制Fig 1.2 The pathogenesis of β thalassemia因此，第一部分拟研究：（1）适于规模化筛查的标本制备。一项好的疾方法要求取材容易，标本便于保存，可长距离运输。干血滤纸片标本仅需样即可制备，试验前处理简单，适应于疾病规模化筛查。（2）地中海贫血液中血红蛋白定性、定量分析标志物的筛选。珠蛋白链水解后产生众多肽须找到 链、β 链各自的特征肽段，并结合突变类型，从这些特征肽段中选响应最好的肽段，即标志性肽段。（3）LC-MS/MS 筛查地中海贫血采样方。（4）LC-MS/MS 筛查地中海贫血方法的临床效能评价。好的筛查方法应确鉴别患病与否的能力，在重复使用时应有高的可靠性，而且检测成本要低
图 1.5 链 T1(729.4m/z)肽段的 MRM 模式鉴定Fig 1.5 Identification of peptide T1 (729.4 m/z) from globin by MRM mode.6 血红蛋白病筛查指标设计（1）筛查指标设计原理运行构建好的 LC-MS/MS 采样方法，得到所检测标本的原始数据，即仪器物的响应值及相应的质荷比信息，原始数据，通过软件分析，转化为筛查指于临床决策。珠蛋白基因突变引起 a 或 β 珠蛋白链合成缺陷，或是产出分子量（M）改异常珠蛋白（异常血红蛋白病），或是造成珠蛋白链合成缺失或不足（地中）。实验时，珠蛋白链可以用完全酶解后的每个特征片段代表，如 β-T1 VHLTP
【参考文献】
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3 王燕燕;李晓辉;徐西华;;地中海贫血诊治进展与我国现状[J];中国实用儿科杂志;2013年06期
4 王跃;周文生;;前列腺癌诊断方法及研究进展[J];中华全科医学;2010年03期
5 马麒;单玉喜;;经直肠超声诊断前列腺癌的研究进展[J];中国介入影像与治疗学;2009年06期
本文编号：2854208
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