我国发热呼吸道症候群中人呼吸道合胞病毒的基因特征研究

发布时间：2020-10-25 21:36

【摘要】：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial virus,HRSV)是全球范围内引起婴幼儿急性下呼吸道感染的常见病原体之一,严重威胁婴幼儿的生命健康。针对HRSV流行,全球既无安全有效的疫苗应用于临床,也无有效的治疗方法。欧美等国家目前应用帕丽珠单克隆抗体预防早产儿等高危婴幼儿的感染,但我国尚未引进。粘附蛋白G(attachment glycoprotein,G 蛋白)和融合蛋白 F(Fusion glycoprotein,F 蛋白)是目前HRSV抗体、疫苗和其他治疗方法的研制热点。然而,我国与这些研究相关的HRSV病毒学基础数据尚不全面,制约着我国HRSV抗体和疫苗的研制。本研究通过选取我国不同代表地域HRSV标本进行病原学鉴定,阐明我国HRSV分子流行病学特点,明确HRSV基因型分布情况、基因型更替及病毒分子进化规律;在此基础上进一步解析HRSV重要膜表面糖蛋白(G和F蛋白)的基因特征和重要抗原位点的变异变迁规律;为我国本土 HRSV疫苗、抗体和治疗药物的研制以及HRSV防控提供重要基础数据和理论支持。本研究通过对2008～2015年我国东北、华北、西北、华东、华中、华南地区发热呼吸道症候群监测病例的鼻咽拭子标本进行HRSV实验室检测,对我国发热呼吸道症候群中HRSV的基因特征及临床特点进行系统分析。结果如下:1、2008～2015年期间共收集发热呼吸道症候群病例鼻咽拭子标本4246份,HRSV核酸检测阳性标本705份,阳性检出率为16.60%。2008～2015年间HRSV A、B亚型在我国不同地域均有检出,在HRSV流行过程中呈现A、B亚型/基因型更替流行特点。在2008～2010年期间,我国HRSV以B亚型流行为主,2010～2013年则以A亚型流行为主,2013～2014年呈现A、B亚型共流行,在2015年再次以A亚型流行为主。提示我国HRSV在同一个流行季多以1个亚型流行为主,同时也存在A、B亚型共流行现象;每2～3个流行季HRSV会出现A、B亚型的更替。此外,我国HRSV A亚型共监测到GA2、GA5、NA1、NA3、NA4和ON1计6个基因型,在HRSV流行过程中同时也存在着基因型更替现象,其中ON1基因型在2013年之后取代NA1基因型成为我国HRSV优势基因型。B 亚型共监测到GB(GB2 和 GB3)、SAB4、CB1 和 BA(BA9、BA10、BAc、BA7 和BA)9个基因型,其中BA9基因型是我国B亚型的优势流行基因型。2、通过G蛋白编码基因全长核苷酸序列和G蛋白羧基末端第二高变区靶基因核苷酸序列进行比较分析,进一步证实了 G蛋白第二高变区作为HRSV基因定型靶基因的可靠性。我国HRSV G蛋白编码基因氨基酸变异主要发生在第二高变区,且突变类型较多,存在插入,缺失以及糖基化位点丢失等现象。而在中和位点区和CX3C模序区(模拟CX3C分子与CX3CR结合介导免疫反应)氨基酸序列相对保守。3、我国HRSVF蛋白相对保守,HRSVF蛋白氨基酸同源性在99.00%以上。而结合全球20多个国家HRSV F蛋白序列,F蛋白氨基酸同源性≥98.00%。同时中国HRSV序列在抗原位点II区绝对保守,说明中国本土流行株对帕丽珠单克隆抗体敏感。4、分子进化结果显示我国HRSV G基因第二高变区的进化速率较高。ON1基因型核苷酸进化速率为1.80×10-3(95%HPD:1.46×10-3～2.66×10-3)碱基替代/位点/年。BA9基因型核苷酸进化速率为4.38×10-3(95%HPD:2.81×10-3～6.12×10-3)碱基替代/位点/年。F基因进化速率较低(0.53～0.70×10-3碱基替代/位点/年),种群动态分析显示HRSVF基因在过去的60余年相对稳定。基于上述结果,本研究首次系统地分析了 2008～2015年我国发热呼吸道症候群中HRSV基因特征,初步阐明了我国HRSV亚型/基因型时空分布情况及流行传播规律,明确了我国HRSV G、F蛋白基因特征和重要抗原位点的变异变迁规律,完善了我国对HRSV病毒分子进化规律的认识,建立了我国本土流行HRSV基因数据库,为中国HRSV诊断方法的建立、种子疫苗株的筛选、预防性HRSV中和抗体的评价和治疗性药物的研发提供了重要的HRSV本土基础研究数据。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R56;R446.5
【图文】：

图３?ＲＳＶ?（Ｓｔｒａｉｎ：丨ｏｎｇ，?ＡＴＣＣ?ＶＲ－２６）?Ｆ蛋白一级结构示意图??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＲＳＶ?Ｆ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（Ｓｔｒａｉｎ：?ｌｏｎｇ，?ＡＴＣＣ－ＶＲ－２６）??ＳＰ：?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＰＥＰ２７：?Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ?２７?ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＦＰ：?Ｆｕｓｉｏｎ?ｐｒｏｔｅｉｎ；?ＨＲＡ：?Ｈｅｐｔａｄ?ｒｅｐｅａｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?Ａ；?ＨＲＢ：??Ｈｅｐｔａｄ?ｒｅｐｅａｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?Ｂ；?ＴＭ：?Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ?ｒｅｇｉｏｎ；?ＣＰ：?Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ?ｄｏｍａｉｎ??综上，Ｇ蛋白和Ｆ蛋白是ＨＲＳＶ重要表面糖蛋白，是刺激机体产生中和抗体的重要??抗原。Ｇ蛋白介导病毒对感染宿主细胞的粘附以及机体免疫反应。Ｆ蛋白促进相邻细胞??的融合，导致局部细胞病变，在人体免疫中具有重要作用。虽然针对Ｇ蛋白的单克隆抗??体，在两个亚型之间不能产生良好的交叉保护效果?＇但是针对Ｇ蛋门的某些保守区域，??通过基因突变等方法仍然能够产生具有－？定交叉保护效果的抗休，并且引起较低的免疫??反应，说明Ｇ蛋白某些片段对机休免疫系统的作用仍具有研究的价值４５。Ｆ蛋白具有高??度保守性，虽然针对Ｆ蛋丨的抗体能够在Ａ、Ｂ亚型之间形成较好的交叉保护效果３８。??但是在抗原位点ＩＩ区某些位点的突变能够导致对帕丽珠单抗的抵抗?＇?说明某些位点的??，且，

２、荧光定量ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ结果??根据双通道荧光定量ＰＣＲ的方法根据ＣＴ值来进行ＨＲＳＶ标本及亚型的鉴定。如??图４，蓝色的为ＨＲＳＶＡ亚型阳性标本ＣＴ值鉴定图谱，图中可见标准的Ｓ型曲线，ＣＴ??值为１２．００。红色的为ＨＲＳＶＢ亚型ＣＴ值鉴定图谱，图中可见Ｓ曲线，ＣＴ值在１５．００??和２８．００。ＣＴ值在３５以内且出现明显的Ｓ曲线或在尾端上抬高均为阳性。??Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??２０００?－?＾?－??Ｉ?：??１５００?４－??／????？－－??，！?／?＾????＊１０００?－?■?１??－?■?？???■???—?■?■?＊?＊?－??．｜?：?ｎ?＾??５００?—?／？?／？?ｖ?－??＿Ｌ＿＿??０?１０?２０?３０?４０??Ｃｙｃｌｅｓ??图４?ＨＲＳＶＡ?（蓝色）和Ｂ?（红色）亚型荧光定量阳性结果图??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｔｈｅ?ＣＴ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅ?ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ａｓ?ＨＲＳＶ?Ａ?（Ｂｌｕｅ）?ａｎｄ?Ｂ?（Ｒｅｄ）?ｂｙ?ｒｅａｌｔｉｍｅ??ＲＴ－ＰＣＲ?ｍｅｔｈｏｄ??对ＨＲＳＶ荧光定量鉴定为阳性的标本，进行靶基因扩增，扩增后的产物经过琼脂糖??凝胶电泳鉴定。结果在目的条带大小处出现明亮目的条带即为扩增成功，图５中可见在??５００ｂｐ左右均可见到明亮目的条带，提示靶基因扩增成功。Ｆ基因和Ｇ基因的扩增均可??３４??

３、病毒分离及复苏结果??送至中国疾预防控制中心（ＣＤＣ）病毒病所麻疹室的临床标本均未成功病毒分离，??原始病毒株成功复苏１０株。病变形态见图７，普通光学显微镜下，与细胞对照相比，可??见细胞融合形成多核巨细胞，甚至聚集成团。??图７?ＨＲＳＶＨｅｐ－２细胞病变图??Ｆｉｇｕｒｅ?７?Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ?ｅｆｆｅｃｔ?（ＣＰＥ）?ｏｆ?ＨＲＳＶ?ｏｎ?Ｈｃｐ－２?ｃｅｌｌｓ??３５??

本文编号：2855985