远程缺血后处理对大鼠心肺复苏后海马神经元自噬和凋亡的影响及其机制

发布时间：2020-10-26 20:47

　　 背景:心跳骤停(cardiac arrest,CA)是指心脏泵血功能的陡然停止,是严重危害人类健康与生存的急危重症之一。据统计,在我国每年超过50万人发生CA。CA后脑损伤是导致患者后期死亡的重要原因。自噬(autophagy)是指细胞内的长寿命蛋白质以及受损的细胞器经溶酶体途径被降解的过程,广泛参与生长发育、免疫、新陈代谢和老化等生理性过程,普遍存在于真核细胞中。近期研究表明自噬过度激活可导致细胞死亡。细胞凋亡是心跳骤停心肺复苏后大脑的主要病理变化。远程缺血处理是在远端器官或部位进行短暂的、非致死性缺血和再灌注的处理方式。研究表明远程缺血后处理可改善心肺复苏后的神经功能障碍,其保护机制与自噬的关系有待深入研究。目的:探讨远程缺血后处理对大鼠心肺复苏后海马神经元自噬和凋亡的影响及其机制。方法:①选用雄性SD大鼠通过诱导窒息建立心跳骤停心肺复苏后脑损伤模型。②30只雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=6)、心跳骤停心肺复苏组(CA/CPR组,n=24),CA/CPR组分别于自主循环恢复(ROSC)后3h、6h、24h、72h处死大鼠取脑海马组织,用Western blot法检测与自噬活性有关的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白和与线粒体自噬活性有关的Parkin蛋白表达,免疫荧光法检测LC3在神经元细胞的定位,透射电子显微镜观察神经元细胞自噬小体的形成和细胞超微结构。③50只雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组)、心跳骤停心肺复苏组(CA/CPR组)、远程缺血后处理组(RIPostC组),以ROSC后24h为实验终点。远程缺血后处理是指在成功复苏后立即用动脉夹夹闭左侧股动脉5min,释放5min,重复3个循环。在自主循环恢复(ROSC)后不同时间点对各组大鼠进行神经功能缺损评分(NDS),Western blot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、Parkin和P53线粒体转位情况,用TUNEL法检测海马组织神经元细胞凋亡,免疫荧光法检测LC3在神经元细胞的定位,免疫荧光双标法检测线粒体P53的表达,透射电子显微镜观察神经元细胞自噬小体的形成和细胞超微结构。结果:①心跳骤停大鼠自主循环恢复(ROSC)后6h、24h、72h脑海马神经元细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、线粒体Parkin表达与Sham组比较,均明显增高(P0.05),ROSC后24h蛋白表达量处于峰值,复苏后脑组织免疫荧光吸光度值较Sham组升高(P0.05)。②与CA/CPR组相比,RIPostC组大鼠复苏后NDS评分升高,海马组织神经元细胞凋亡减少,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达下降,线粒体Parkin和P53转位减少,神经元细胞自噬泡减少,线粒体超微结构损伤减少。结论:本研究结果表明大鼠心跳骤停后5min开始心肺复苏可建立稳定的复苏后脑损伤模型。ROSC后6h海马神经元细胞自噬活性增强,自噬(包括线粒体自噬)水平呈现先升后降的趋势,于复苏后24h处于峰值,72h仍处于激活状态。远程缺血后处理可改善大鼠心肺复苏后的神经功能,这可能与抑制神经元细胞过度自噬(包括线粒体自噬)和P53线粒体转位诱导的细胞凋亡有关。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

??核固缩、裂解严重（图１－１Ｂ）。??１．４．４两组大鼠脑海马组织神经元细胞凋亡比较??为进一步证明模型是否成功，本部分检测了两组大鼠海马神经元细胞凋亡情??况。如图１－２所示，荧光染色后，正常的细胞核显蓝色，而ＴＵＮＥＬ阳性的细胞核呈粉??红色。Ｓｈａｍ组凋亡细胞较少，凋亡率为（１．６８±０．?７６）?％；?ＣＡ／ＣＰＲ组凋亡细胞较??多，凋亡率为（１７．?７１±６．?７５）?％?；差异有统计学意义（Ｐ＜０．?０５）。详见图１－２。??表１－２两组大鼠复苏后不同时间点ＮＤＳ评分??Ｔａｂｌｅ?１?－２?ＮＤＳ?ｓｃｏｒｅｓ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ?ａｆｔｅｒ?ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｔｗｏ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??组别?２４ｈ?４８ｈ?７２ｈ??Ｓｈａｍ?组?７９．４±０．９?８０．０±０．０?８０．０±０．０??ＣＡ／ＣＰＲ?组?５丨．１?±２．９＊?５５．７土３．０＊?５９．４±２．５＊??注：与Ｓｈａｍ组相比，卞＜０．０５??ｌ＇?＊?＊?＂?１?．．??？?．?ｍ?？?？??ｒ?？?０?．?－?＊?？??ｔ??？?■?Ｖ?？?％?＊?＜??．?．．?．ｆ．．?Ｉ??？、?（?＼?｜?｜??ｆ?Ｊ?＿?Ｉ??＇、？?？?ｒ?？?？?？?‘?．?？，?’?．?？?？二＇?４?，?＇??？?？?：?％??Ａ?Ｗｉ?Ｂ．－．?；，??图１－１复苏后２

??核固缩、裂解严重（图１－１Ｂ）。??１．４．４两组大鼠脑海马组织神经元细胞凋亡比较??为进一步证明模型是否成功，本部分检测了两组大鼠海马神经元细胞凋亡情??况。如图１－２所示，荧光染色后，正常的细胞核显蓝色，而ＴＵＮＥＬ阳性的细胞核呈粉??红色。Ｓｈａｍ组凋亡细胞较少，凋亡率为（１．６８±０．?７６）?％；?ＣＡ／ＣＰＲ组凋亡细胞较??多，凋亡率为（１７．?７１±６．?７５）?％?；差异有统计学意义（Ｐ＜０．?０５）。详见图１－２。??表１－２两组大鼠复苏后不同时间点ＮＤＳ评分??Ｔａｂｌｅ?１?－２?ＮＤＳ?ｓｃｏｒｅｓ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ?ａｆｔｅｒ?ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｔｗｏ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??组别?２４ｈ?４８ｈ?７２ｈ??Ｓｈａｍ?组?７９．４±０．９?８０．０±０．０?８０．０±０．０??ＣＡ／ＣＰＲ?组?５丨．１?±２．９＊?５５．７土３．０＊?５９．４±２．５＊??注：与Ｓｈａｍ组相比，卞＜０．０５??ｌ＇?＊?＊?＂?１?．．??？?．?ｍ?？?？??ｒ?？?０?．?－?＊?？??ｔ??？?■?Ｖ?？?％?＊?＜??．?．．?．ｆ．．?Ｉ??？、?（?＼?｜?｜??ｆ?Ｊ?＿?Ｉ??＇、？?？?ｒ?？?？?？?‘?．?？，?’?．?？?？二＇?４?，?＇??？?？?：?％??Ａ?Ｗｉ?Ｂ．－．?；，??图１－１复苏后２

缺氧等损伤状况导致线粒体出现氧化应激和功能丧失时，ＰＩＮＫ１转运受阻，聚集于线??粒体外膜，使Ｐａｒｋｉｎ蛋白磷酸化并转位至受损线粒体，这一过程使Ｅ３泛素链接酶??被激活，从而激活随后的线粒体自噬过程［１６＇１７１?（如图２－２）。??Ｐ５３是一种广为人知的抑癌基因，由１１个外显子和１０个内含子构成，位于人类??１７号染色体上，由转录激活结构域、寡聚结构域、ＤＮＡ结合域和非ＤＮＡ结合域组??成，编码９３个氨基酸，分子量为５３ｋＤａ的核内磷酸化蛋白。Ｐ５３蛋白介导的细胞信??号途径可参与多种细胞生命活动，如调控细胞周期、细胞分化、细胞凋亡和坏死等??正常细胞代谢过程近期有研究表明Ｐ５３能同时参与细胞凋亡和细胞自噬过程??［２°］。Ｐ５３调控的细胞凋亡主要包括Ｐ５３转录依赖性和Ｐ５３非转录依赖性［２１］，其中??Ｐ５３非转录依赖性的细胞凋亡主要是指细胞质中的Ｐ５３在凋亡刺激作用下，转位至受??损的线粒体，造成线粒体膜通透性转换孔的开放，使细胞色素Ｃ从线粒体释放入细??胞质
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本文编号：2857508