苯丙氨酸羟化酶基因多位点突变检测方法的建立及其在临床样本检测中的初步应用
发布时间：2020-10-27 22:44
单核苷酸多态性和遗传病发生密切相关,引起遗传病的单核苷酸变化称为基因突变。单基因遗传病主要是单个或多个位点等位基因的碱基发生突变而直接导致该基因的功能缺失或减弱,从而表现出可遗传的机体功能缺陷。目前基因突变检测如DNA微阵列、质谱等方法需要繁琐的操作步骤、较长的时间以及昂贵和复杂的仪器设备,这些方法不再适用于临床应用中对基因突变位点的快速筛查。本研究通过结合突变扩增阻滞系统和金磁微粒组装的免疫层析侧向流技术,建立了一种灵敏、低成本、易于普适的多位点突变的基因分型方法,检测结果可被磁定量检测仪自动识别,也可以通过肉眼直观观察层析系统的检测线上是否存在被捕获的金磁微粒探针而产生颜色的变化,进而实现基因型判读。课题选择苯丙酮尿症的致病关键酶—苯丙氨酸羟化酶为研究对象,建立了苯丙氨酸羟化酶基因7个突变位点的检测方法,通过对所构建质粒苯丙氨酸羟化酶基因检测效果的评价,体现了方法的高灵敏度和强特异性。将该方法进一步开展临床检测的初步应用,对于北京协和医院收集的23个家系中苯丙酮尿症患儿及父母双方共69个血液样本进行苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测,对比基因测序的结果,该方法检测的一致率达到97.8%,表明该检测方法在基因多位点突变导致的相关遗传病筛查中具有潜在的临床应用价值。
【学位单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R440
【部分图文】：
第一章 绪论PAH，612349）及其辅酶四氢生物蝶呤（BH4）的催化作用下转变为酪氨酸，再酪氨酸的代谢途径转化为黑色素、多巴胺及肾上腺素等生理活性物质[23]。苯丙氨代谢通路见图 1-1。按基因缺陷的不同，PKU 可分为经典型和非经典型两类。经 PKU 是由于 PAH 基因突变而导致基因功能缺陷，使苯丙氨酸不能转化为酪氨酸病。非经典型 PKU 是由于 PAH 的辅酶 BH4合成通路障碍所引起。BH4的前体鸟磷酸及鸟苷三磷酸环化水合酶、6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶、二氢生物蝶呤还原酶呤-4α-甲醇胺脱水酶等异常都能导致 BH4缺乏。非经典型 PKU 除了典型 PKU 的表现之外，神经系统的异常表现比较突出，如躯干肌张力减弱、四肢肌张力增自主地运动、震颤，顽固性惊厥等[24, 25]。其中经典型 PKU 占绝大部分，占 PKU的 98%-99%[24, 26]。不同的致病原因所对应的治疗方法也不同，因此，及时筛查确诊断 PKU 确切的致病原因对患者的治疗至关重要。
水和绒毛细胞中不表达。因而不能通过检测羊水中的酶活来进行 PKU 的产前诊断，只能通过检测 PAH 基因是否突变而进行产前基因诊断[29]。因此，建立一种方便、快速、准确的 PAH 基因突变的检测方法在临床 PKU 诊断及治疗中就十分必要。1.2 苯丙氨酸羟化酶基因概述1.2.1 苯丙氨酸羟化酶基因的分子生物学1983 年，Woo 等克隆了被公认的 PKU 致病基因——PAH 基因[30]。如图 1-2 所示[31]，PAH 基因定位于人类染色体的 12q23.2，该区域的长度约为 1.5Mb，除了 PAH 基因外，该区域还包括其他 5 个基因[32]。PAH 基因由 13 个外显子和 12 个内含子组成，基因全长 171266bp。转录时剪接内含子形成 1353bp 的编码序列，翻译合成包含 45个氨基酸的单体蛋白。PAH 由四个 PAH 单体蛋白通过亚基缔合而成一个有功能的四聚体，作为该酶的功能单位[33, 34]。PAH 基因主要在肝脏中表达。
第一章 绪论的功能做了开创性的工作[35]。1999 年，Kobe 等运用质谱技术和 X 射线衍成功构建了 PAH 基因的 3D 晶体结构模型[36]。如图 1-3 所示，PAH 基因通常活性的四聚体存在。此模型从结构生物学的角度为研究 PAH 基因突变对蛋和功能的影响机制奠定了基础。2003 年，Scriver 等对 PAH 基因突变的数据统计分析，并从基因突变体外表达以及基因突变对蛋白质结构影响的角度判引发的基因功能缺失[33]。该研究发现 PAH 基因突变的错义突变占 63%，突分子机制是突变基因翻译产生的蛋白质异常卷曲而导致其结构不稳定，最终降解，造成酶催化活性的降低。还有一些突变是由于基因的异常剪接引起。剪接位点的碱基突变而导致基因的重编辑系统无法识别，破坏了 GT-AG 法异常的编码序列，最终产生功能异常的蛋白。
【参考文献】
本文编号：2859175
【学位单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R440
【部分图文】：
第一章 绪论PAH，612349）及其辅酶四氢生物蝶呤（BH4）的催化作用下转变为酪氨酸，再酪氨酸的代谢途径转化为黑色素、多巴胺及肾上腺素等生理活性物质[23]。苯丙氨代谢通路见图 1-1。按基因缺陷的不同，PKU 可分为经典型和非经典型两类。经 PKU 是由于 PAH 基因突变而导致基因功能缺陷，使苯丙氨酸不能转化为酪氨酸病。非经典型 PKU 是由于 PAH 的辅酶 BH4合成通路障碍所引起。BH4的前体鸟磷酸及鸟苷三磷酸环化水合酶、6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶、二氢生物蝶呤还原酶呤-4α-甲醇胺脱水酶等异常都能导致 BH4缺乏。非经典型 PKU 除了典型 PKU 的表现之外，神经系统的异常表现比较突出，如躯干肌张力减弱、四肢肌张力增自主地运动、震颤，顽固性惊厥等[24, 25]。其中经典型 PKU 占绝大部分，占 PKU的 98%-99%[24, 26]。不同的致病原因所对应的治疗方法也不同，因此，及时筛查确诊断 PKU 确切的致病原因对患者的治疗至关重要。
水和绒毛细胞中不表达。因而不能通过检测羊水中的酶活来进行 PKU 的产前诊断，只能通过检测 PAH 基因是否突变而进行产前基因诊断[29]。因此，建立一种方便、快速、准确的 PAH 基因突变的检测方法在临床 PKU 诊断及治疗中就十分必要。1.2 苯丙氨酸羟化酶基因概述1.2.1 苯丙氨酸羟化酶基因的分子生物学1983 年，Woo 等克隆了被公认的 PKU 致病基因——PAH 基因[30]。如图 1-2 所示[31]，PAH 基因定位于人类染色体的 12q23.2，该区域的长度约为 1.5Mb，除了 PAH 基因外，该区域还包括其他 5 个基因[32]。PAH 基因由 13 个外显子和 12 个内含子组成，基因全长 171266bp。转录时剪接内含子形成 1353bp 的编码序列，翻译合成包含 45个氨基酸的单体蛋白。PAH 由四个 PAH 单体蛋白通过亚基缔合而成一个有功能的四聚体，作为该酶的功能单位[33, 34]。PAH 基因主要在肝脏中表达。
第一章 绪论的功能做了开创性的工作[35]。1999 年，Kobe 等运用质谱技术和 X 射线衍成功构建了 PAH 基因的 3D 晶体结构模型[36]。如图 1-3 所示，PAH 基因通常活性的四聚体存在。此模型从结构生物学的角度为研究 PAH 基因突变对蛋和功能的影响机制奠定了基础。2003 年，Scriver 等对 PAH 基因突变的数据统计分析，并从基因突变体外表达以及基因突变对蛋白质结构影响的角度判引发的基因功能缺失[33]。该研究发现 PAH 基因突变的错义突变占 63%，突分子机制是突变基因翻译产生的蛋白质异常卷曲而导致其结构不稳定，最终降解，造成酶催化活性的降低。还有一些突变是由于基因的异常剪接引起。剪接位点的碱基突变而导致基因的重编辑系统无法识别，破坏了 GT-AG 法异常的编码序列，最终产生功能异常的蛋白。
【参考文献】
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本文编号：2859175
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