面向大视场成像与便携式血细胞计数的样品制备策略

发布时间：2020-10-30 20:19

　　 血细胞计数是最常规的临床检测之一,对疾病的初步诊断和筛查具有重要的指导意义。大量研究显示,基于流式或成像的便携式血细胞计数仪器具备准确的血细胞计数能力,但这些方法普遍存在的问题是:简单的实验操作只能获得单一的参数,或者需要使用多种试剂来进行复杂的样品前处理,或者需要多个仪器部件来实现多个参数的检测。本课题组前期开发了一套基于血细胞大视场成像的小型显微镜系统,实现了对血细胞的准确计数,但该方法采用了表面活性剂与荧光染料分别对血样进行红细胞球化和白细胞、血小板染色,它们的混合物对染色的荧光强度造成较大影响。同时,该方法进样时使用的是商业样品池,其厚度为精确的100μm,价格较为昂贵。这样的样品制备方法达不到便携式检测的实际需求。为了解决这个问题,我们开发了一套面向便携式血细胞计数的简单、高效的样品制备方法,其主要内容包括:(1)选择两性表面活性剂N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵内盐(DOPS),代替阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)。DOPS对白细胞和血小板荧光染色的强度没有影响,因此与荧光染料具有良好的兼容性。同时,DOPS可以将红细胞球化成规整形态,且适用的血样具有较宽的血细胞密度范围。通过调整DOPS的浓度,结合染色剂浓度、环境pH及盐离子浓度的优化,我们确定了最佳的血样制备条件。(2)通过调节血液稀释倍数和控制样品池深度,设计样品池,使血细胞形成密度适中的单层分布。实验结果表明,这种样品池的效果不仅可以替代商业样品池,还较大幅度的降低了成本。将其与前述血样制备的最佳条件相结合,我们实现了血样的快速制备,以及红细胞、白细胞和血小板的准确计数。(3)将DOPS与荧光染料吖啶橙(AO)以干剂形式预埋在离心管中,这种预储存的策略,使试剂储存时间增长,保证了样品制备的的重现性,并且可实现多个参数的检测。该方法可进一步推进大视场显微成像的技术应用于便携式血细胞计数的检测。
【学位单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R446.1
【部分图文】：

ＭＡＳＴＥＲ＇Ｓ?ＴＨＥＳＩＳ??在过去几十年，诊断技术已大大改善Ｗ。检测设备根据其尺寸和操作复杂性不??同可分为三大类Ｍ，如图１．１，第一，医院或者中心实验室分析设备；第二，较大的??台式设备，其本质上是尺寸和复杂性降低的实验室仪器。包括重症监护分析仪、小??型血液分析仪和免疫学分析仪Ｗ。随着该领域设备的开发，未来几年可能进入商业??化市场；第三，小型手持设备，对越来越多的分析物提供定性或定量检测。应用最??广泛的技术是葡萄糖生物传感器试纸条［９］和使用固定抗体侧向层析［１（）］检测一系列参??数，包括心脏标志物和感染性病原体等。最终可提供给未经任何培训的人以自动化??的检测模式提供快速的定性或定量分析。??％?一一?咨?ｍｍ??Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｕｓｅ?ｔ?ＢＨ??Ｂｅｎｃｈ－ｔｏｐ?＾?：??＾?．…＂？?－??ｃ?ｍｍ??Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｕｓｅ?Ｉ?Ｉ?＾??Ｈａｎｄｈｅ，ｄ?＾??图１．１基于尺寸和便携性对分析设备的分类Ｍ。图ａ表示医院或者中心实验室分析设备。图ｂ??表示台式便携式分析仪器。图ｃ表示手持便携式分析仪器。??ＰＯＣＴ为达到现场即时检测，通常需要其具有快速、简单、成本低、便携、使??用后可丢弃、易处理等特点。具体来说，患者和医务人员提供的临床设备能够实现??真正的ＰＯＣＴ系统

，ＰＣ。??（１）基于微流控芯片的ＰＯＣ检测??微流控芯片是一块微米级别的芯片，横截面在１?－５００?ｐｍ范围内，用来实现对??生物、化学、医用临床样本进行分离、富集、分析等过程。微流体领域直到２０世纪??９０年代才获得大量关注＠１。最初使用的材料是硅和玻璃，后来发展到聚合物，特别??是聚二甲基硅氧烷（ＰＤＭＳ）。从此，各种各样的材料应用于该领域。这些材料大致??分为三大类：无机材料，聚合物和纸张［２１］。在微流体装置中添加电泳或者泵，为流??体的控制和分离提供了非机械方法，其操作简便、使用快速并且价格低廉的软光刻??技术进一步推进了微流控技术的发展［２２］。现在可直接从微流控芯片制造商中如??Ｄｏｌｏｍｉｔｅ获得商业微流体系统。??微流体系统具有尺寸小，流通时间短等优点。较小的通道尺寸，测试和分析所??需的样品或试剂量也较少，有利于便携式设备进行现场测试（假设相关的硬件具有??类似的便携性）。在微流体装置中同时集成多个过程（如标记，纯化，分离和检测??等），广泛运用于单细胞分析、药物筛选、环境监测和太空探索等多个领域。??Ｆａｎ［２３］报道了一种集成的微流控编码芯片。如图１．２，用于微量血液中的蛋白质??含量的快速多重分析。该系统采用指尖血，通过Ｚｗｅｉｆａｃｈ－Ｆｕｎｇ效应分离得到血浆，??在血浆通道内采用多个ＤＮＡ编码的抗体进行原位蛋白质测量。??

糾学位论文??ＭＡＳＴＥＲ＇ＳＴＨＥＳＩＳ??（２）基于纸基的ＰＯＣ检测??以纸为分析载体，最早可以追溯到１９世纪近代化学ｐＨ试纸条的使用。２００７年??哈佛大学Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ［２４］组发明纸质微流控芯片后，纸基微流控分析装置便快速发展。??现在最常见的纸基检测产品糖尿病试纸条和验孕试纸条被大家所公认［２５，２６］。??微流体纸分析设备，在过去十几年中蓬勃发展［２７］。主要具有以下独特的属性：??（１）纸张材料便宜且易获得；（２）材料可以通过简单处理，对环境无害；（３）材??料具有易成型和图案化功能；（４）纸的多孔结构有利于流体的无泵芯吸；（５）纸??具有生物相容性；（６）纸可以通过表面修饰等进行化学改性；（７）通常纸的白色??背景为基于颜色的检测提供了对比方法呢２９］。试纸条［３（）］、侧向层析试纸条（ＬＦＡ）??［３１，Ｍ和基于纸的分析设备１２８］已广泛运用于健康检测、环境保护、食品工业方面分析。??
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本文编号：2862958