双功能复合载体的构建及其基因递送和生物成像研究

发布时间：2020-10-31 22:32

　　 基因治疗是最有希望治愈恶性肿瘤的方法之一,其中基因载体的开发是核心,而具有基因递送和生物成像的双功能载体是一个重要的发展方向。稀土上转换纳米晶(UCNPs)是一种新型的荧光探针,在生物医学中有着广泛的应用前景。据此,本研究使用阳离子三肽类脂包覆β-NaYF4:Yb3+,Er3+上转换纳米晶构建双功能复合基因载体,进行基因递送和生物成像性能研究。使用高温油相法,以稀土氯化物(YCl3·6H2O,YbCl3·6H2O,ErCl3 6H2O)为原料,油酸(OA)为表面活性剂,1-十八烯(ODE)为反应溶剂,合成Yb3+、Er3+掺杂的β-NaYF4:Yb3+,Er3+。通过X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)等表征手段,进一步筛选出粒径均匀,符合生物应用的β-NaYF4:Yb3+,Er3+纳米晶,其制备最佳条件:反应3h,300℃,稀土氯化物、OA、NaOH和NH4HF2的摩尔比为 1:19:2.5:2.5。通过薄膜分散法和超声分散法相结合的方式,将阳离子三肽类脂(CD014)包覆到β-NaYF4:Yb3+,Er3+上转换纳米晶表面,构建复合纳米基因载体β-NaYF4:Yb3+,Er3+@CD014(CSLNs)。通过激光粒度仪和透射电子显微镜对所构建的CSLNs的粒径和微观形貌进行了表征,结果表明CSLNs呈球形结构,粒径均匀且尺寸在50 nm左右;CSLNs粒子Zeta电位为+80 mV。琼脂糖凝胶电泳实验表明,在CSLNs与Luc-siRNA质量比大于4/1时,Luc-siRNA被完全延滞,CSLNs与Luc-siRNA形成稳定的复合物。以CSLNs为基因运载工具,对肿瘤细胞进行了细胞摄入、介导Luc-siRNA的沉默效率等体外基因递送研究。结果表明,在CSLNs与Luc-siRNA质量比大于3/1时,对A549、HeLa、NCI-H460和Heβ-2等细胞株的摄入率均达到75%以上,高于商品试剂DOTAP和Liβofectamine 2000;通过透射电子显微镜检测超薄细胞切片,转染30 min后观察到CSLNs有效地进入A549细胞内,转染4h后,可清晰地观察到六边形上转换纳米晶。通过CSLNs运载Luc-siRNA转染A549细胞,对荧光素酶基因的沉默率最高达60%,与商品转染试剂DOTAP和Liβofectamine 2000相当。使用CSLNs对A549细胞进行转染,检测多种肿瘤细胞株的上转换发光成像。在980 nm激光激发下,荧光显微镜检测到CSLNs在胞内发出明亮的黄绿色荧光,实现了上转换荧光成像,可作为肿瘤细胞的荧光标记,同时也证明CSLNs可有效进入细胞。使用荧光光谱仪检测A549细胞裂解液的上转换发光强度,荧光谱图中显示上转换纳米材料中Er3+的特征峰,与细胞成像时获得明亮的黄绿色荧光结果相一致。为了建立荷瘤小鼠模型,选用BALB/c-nude小鼠在其皮下接种高表达荧光素酶的A549细胞。通过尾静脉将CSLNs注射到小鼠体内,考察CSLNs在活体水平上的上转换发光成像。结果表明,在980 nm激光激发下,在小鼠肿瘤处观察到黄绿色荧光,显示出上转换荧光信号。解剖小鼠后,在其肿瘤、肝及肺等部位观察到了黄绿色上转换荧光,说明复合载体有作为生物探针的潜力。采用MTT法考察CSLNs对A549、HeLa、NCI-H460和Heβ-2细胞株的毒性,所有细胞的存活率均能达到90%以上,CSLNs的细胞毒性均较低,优于商品试剂DOTAP和Liβofectamine2000。荷瘤小鼠经尾静脉注射剂量20mgkg-1的CSLNs,十天内小鼠体重未受影响,生化指标在正常范围内,证明CSLNs对小鼠没有明显毒性。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R450;O657.3
【部分图文】：

基因治疗??因治疗（ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ）是将外源基因导入靶细胞，通过纠正、补偿基因缺陷或异常，达到治疗疾病的Ｈ的。基闪治疗是－？种现代生物医学技术，是最有希望的方法之一，一直是近年来的研究热点。经过近３０年的发展，ＤＮＡ重组和基

Ｆｉｇ．?１．３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｈａｓｅｓ?ｆｏｒ?ｇｅｎｅ?ｔｈｅｒａｐｙ?ｉｎ?ｃｌｉｎｉｃａｌ?ｔｒｉａｌｓ??前基因治疗主耍有三种方法：（１）通过导入正常基因到靶细胞使其对受损闪进行修复，达到治疗效果；（２）通过导入表达具有治疗功能的蛋臼质如子（ＴＮＦ）的基因到靶细胞，达到直接治疗疾病的０的；（３）通过导入能致病基因合成和表达的治疗基因，在靶细胞内阻断疾病的发生。综上所述，优越性在于它可以在分子水Ｔ？上修复或纠正异常基因的表达。其中在第二种代表性的是ＲＮＡＴ？扰（ＲＮＡ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，?ＲＮＡｉ）。ＲＮＡｉ是ＲＮＡ在序列录后，基因表现为沉默现象的技术，在基闪治疗研宄中越来越受到研宂者的ＲＮＡｉ的过程是内源性或者外源性的双链ＲＮＡ与细胞内的同源序列信使Ｒｓｅｎｇｅｒ?ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）结合并使之降解，而产生ＲＮＡ干扰作用的基因则称为Ａ?（ｓｍａｌｌ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ?ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）叫。??前，ｓｉＲＮＡ通常由２１－２３个碱基对构成，具有极强的基因抑制能力和较好的，其基因沉默效率比传统的核酶和反义核苷酸高出几十倍甚至上千倍，极具近年来，ｓｉＲＮＡ已广泛应用在癌症等重大疾病的治疗中，取得了预期的治疗传统的治疗基因方式相比，ｓｉＲＮＡ具有一定的缺陷，活体内的核酸酶等物质

双功能复合载体的构建及其基因递送和生物成像递送：主要是皮内或肌肉注射、基因枪以及电穿孔；（２）化学转染：主要使用多肽或蛋白、脂质体、壳聚糖等基因载体进行治疗基因的递送。??基因递送载体??根据上文叙述，外源基因进入靶细胞并完成基因表达的过程受诸多因素影响，可因递送载体与基因结合的方式避免基因在体内转运中受到降解。评价基因递送载要标准是基因递送效率和基因治疗的安全性。其中基因递送载体主要包括两大类载体（ｖｉｒａｌ?ｖｅｃｔｏｒ）和非病毒载体（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ?ｖｅｃｔｏｒ）?［９１。世界范围内临床基因治用的基因递送载体如图１．４所示。??
【参考文献】

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本文编号：2864599