基于PLP-RCA的唐氏综合症产前筛查方法的建立与优化

发布时间：2020-11-01 02:34

　　研究背景及目的:唐氏综合症(DS)是一种常见的不可治愈的染色体病,目前只能通过产前干预的手段阻止患儿的出生。传统的产前筛查方法假阳性率高;快速产前诊断方法其创伤性的取样方式对孕妇和胎儿有一定的损伤风险;无创DNA产前筛查方法借助于成熟的测序公司,成本高、在偏远地区不易普及,因此建立安全、有效、易于推广的DS产前筛查方法至关重要。母体胎儿游离核酸是无创产前诊断最好的样品,但是因其含量低,受母体背景干扰等问题,需要灵敏度高、特异性好的方法对其检测以实现对DS产前筛查。本课题基于锁式探针-滚环扩增(PLP-RCA)具有对单核苷酸多态性(SNP)基因分型及定量能力,拟建立一种灵敏度高、特异性好的PLP-RCA用于DS产前筛查,为无创性的DS产前筛查提供新方法。研究方法:(1)依据胎儿特异表达的基因杂合型“RNA-SNP”等位基因比值定量的方法,选择杂合率较高的胎儿特异基因的SNP。对PLP-RCA的反应体系进行优化,对靶分子浓度与终点荧光值之间的定量关系进行检测,实现PLP-RCA对SNP等位基因分型及比值定量。(2)改进的指数线性PCR(imLATE-PCR)对靶分子进行信号放大产生单链DNA,经过信号放大的靶分子进行PLP-RCA均得到扩增产物,结合imLATE-PCR,PLP-RCA的检测灵敏度提高。(3)用合成的靶分子制备正常人和DS患者的模拟样品,采用荧光定量PLP-RCA对模拟样品进行筛查;用合成的靶分子制备正常人和DS患者的血浆模拟样品,模拟临床样品的待测环境,采用荧光定量PLP-RCA对血浆模拟样品进行筛查。研究结果:(1)确定了21号染色体COL6A2、PLAC4基因上杂合率较高的rs1044598位点、rs7717位点、rs59066201位点,三个位点在人群中的理论覆盖率达到了84.7%。针对3个SNP位点设计锁式探针,优化了PLP-RCA反应体系,实现了对胎儿特异基因上SNP位点的基因分型。荧光定量PLP-RCA分析了两倍浓度差的靶分子与终点荧光值之间有较好的线性关系,可检测到1 nM的靶分子,实现了对胎儿特异基因上SNP等位基因比值定量。(2)设计了3个SNP位点imLATE-PCR的大量引物与限制性引物,均得到单链DNA产物。以这些产物为模板,进行荧光定量PLP-RCA实验并分析了扩增产物浓度与终点荧光值之间的关系,结果二者之间具有较好的线性相关性,可检测到1 pM的靶分子,PLPRCA检测灵敏提高。(3)荧光定量PLP-RCA对正常人和DS患者的模拟样品进行检测,正常人模拟样品SNP等位基因比值接近理论值1:1,DS患者模拟样品SNP等位基因比值接近理论值2:1或1:2,实现了对DS患者模拟样品的检测,进一步实验发现此方法初步实现了对DS患者血浆模拟样品的检测。结论:本研究对PLP-RCA反应体系进行优化,建立了特异性检测唐氏综合症相关SNP位点的方法,实现了PLP-RCA对胎儿特异基因上SNP位点的分型定量,通过增加改进的指数线性PCR反应,提高了PLP-RCA检测灵敏度,初步实现了对DS模拟样品的筛查,为下一阶段临床样品的检测奠定了基础。
【学位单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：O652;R714.5;R440
【部分图文】：