还原敏感响应的基因载体构建及性能研究

发布时间：2020-11-02 21:20

　　 一直以来传统的治疗方法存在着各种各样的弊端,给患者带来痛苦的同时疾病并不能得到根治。随着医学水平的发展,人们开始思考从基因水平上对疾病实施有效且根本性的治疗,基因治疗由此逐渐引起了人们的关注。因此本文开发一种基于还原敏感响应的纳米基因递送系统,利用细胞内高GSH浓度呈现出的还原性环境,实现载体在细胞内更快速的释放基因,从而达到高的转染效率。本论文主要的研究内容及结果如下:1.还原敏感响应基因递送载体的合成及表征。以侧链被二亚乙基三胺(DET)修饰的聚天冬氨酸P[Asp(DET)]为结合基因的亲水段,含有二硫键的胱胺作为连接臂,与疏水性聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA连接合成新的还原敏感响应的基因载体PLGA-ss-P[Asp(DET)](后文统一采用P-ss-P表示)。己二胺代替胱胺,连接PLGA与聚阳离子P[Asp(DET)],合成不含还原敏感二硫键的PLGA-P[Asp(DET)](后文统一采用P-P表示)作为对照;同时不含疏水链段的P[Asp(DET)]作为阳性对照。利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振氢谱(~1H NMR)对P-ss-P的化学结构进行表征,结果表明P-ss-P成功合成。载体P-ss-P在水溶液中能够自组装形成纳米颗粒,透射电镜(TEM)显示纳米颗粒呈分布较均匀的近似球形,粒径在20-30 nm左右,且在144 h内具有较好的稳定性。缓冲能力实验表明P-ss-P具有较好的质子缓冲能力。2.P-ss-P基因载体递送外源基因能力的研究。将载体P-ss-P与报告基因pDsRed2-N1共同孵育制备载体/pDNA复合物并探究其性能。粒径及电位分析结果显示P-ss-P/pDNA复合物的粒径为在100-350 nm之间,最终平稳在120 nm左右,最大电位为30.93 mV。凝胶阻滞实验结果表明P-ss-P能与pDNA较好的结合,并且有效抵抗肝素钠的竞争。同时载体P-ss-P能有效保护pDNA被核酸酶及血清中成分降解。MTT结果显示P[Asp(DET)]、P-ss-P和P-P均具有较低的细胞毒性,并且与P[Asp(DET)]相比P-ss-P表现出更好的生物相容性。体外转染实验结果表明P[Asp(DET)]和P-ss-P均能成功运载外源基因至细胞并顺利表达,不同N/P(4、8、16)下P-ss-P/pDsRed2-N1复合物的转染效率分别为9.0%、22.3%和26.3%。激光共聚焦及细胞流式实验结果表明,P[Asp(DET)]/Cy5-pDNA、P-P/Cy5-pDNA和P-ss-P/Cy5-pDNA复合物均可通过内吞方式被HeLa细胞摄取且摄取量远高于游离pDNA,具有疏水结构的P-P和P-ss-P的细胞摄取量明显高于P[Asp(DET)]组。3.基因载体还原敏感响应性能的研究。DLS实验结果表明P-ss-P在还原条件下表现出了粒径增大现象,而在相同条件下P-P的粒径则无明显变化。电泳实验结果显示在还原条件下P-ss-P与DNA的结合能力有所减弱,并且随着孵育时间的增加,P-ss-P的DNA结合能力逐渐降低,而P-P/pDNA复合物不受还原条件的影响,在0-6 h内均完全结合DNA。在体外细胞转染方面,P-ss-P/pDsRed2-N1显示出比P-P更高的转染效率。上述结果证明了P-ss-P具有较好的还原敏感性质。4.P-ss-P用于体外癌症基因治疗效果的研究。通过MTT细胞毒性实验评估P-ss-P运载治疗基因p53的抑癌效果。与P-P相比,P-ss-P由于能更好运载抑癌基因p53进入癌细胞,表达抑癌蛋白,因而显著抑制癌细胞的生长增殖。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R450
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 基因治疗
    1.2 基因治疗载体
        1.2.1 病毒载体
        1.2.2 非病毒载体
    1.3 刺激响应型基因纳米递送载体
        1.3.1 外源刺激响应型基因纳米载体
        1.3.2 内源刺激响应型基因纳米载体
    1.4 还原敏感响应型基因纳米递送载体研究进展
    1.5 本论文的选题依据及研究内容
2 还原敏感响应载体材料的合成及表征
    2.1 试剂和仪器
        2.1.1 实验试剂及材料
        2.1.2 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 载体材料合成
        2.2.2 载体材料结构分析
        2.2.3 透射电子显微镜分析（TEM）
        2.2.4 稳定性的检测
        2.2.5 缓冲能力分析
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 载体材料的合成及结构分析
        2.3.2 透射电子显微镜分析（TEM）
        2.3.3 载体稳定性检测
        2.3.4 缓冲能力分析
    2.4 小结
3 P-ss-P载体递送外源基因能力的研究
    3.1 试剂和仪器
        3.1.1 实验试剂及材料
        3.1.2 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 P-ss-P/pDNA复合物的制备
        3.2.2 P-ss-P/pDNA复合物的形貌表征
        3.2.3 载体与pDNA结合稳定性检测
        3.2.4 载体对DNA的保护能力分析
        3.2.5 细胞毒性实验
        3.2.6 P[Asp（DET）]/pDNA和 P-ss-P/pDNA体外转染
        3.2.7 P[Asp（DET）]/Cy5-pDNA和 P-ss-P/Cy5-pDNA的细胞摄取实验
        3.2.8 统计学分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 P-ss-P/pDNA复合物的表征
        3.3.2 P-ss-P结合pDNA的能力
        3.3.3 载体对DNA的保护能力分析
        3.3.4 细胞毒性实验
        3.3.5 P[Asp（DET）]/pDsRed2-N1和P-ss-P/pDsRed2-N1 体外转染
        3.3.6 P[Asp（DET）]和P-ss-P的细胞摄取实验
    3.4 小结
4 P-ss-P载体还原敏感响应性能研究及抑癌实验
    4.1 试剂及仪器
        4.1.1 实验试剂及材料
        4.1.2 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 还原环境下的粒径变化
        4.2.2 还原条件下载体与pDNA结合稳定性检测
        4.2.3 P-P/pDsRed2-N1和P-ss-P/pDsRed2-N1 体外转染
        4.2.4 抑癌实验
        4.2.5 统计学分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 还原环境下载体粒径变化的结果
        4.3.2 还原条件下载体与pDNA结合稳定性的检测
        4.3.3 P-P/pDsRed2-N1和P-ss-P/pDsRed2-N1 体外转染
        4.3.4 抑癌实验结果
    4.4 小结
结论
参考文献
致谢

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本文编号：2867584