万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌二元调控系统VraSR在细菌致病性中的作用研究

发布时间：2020-11-05 07:31

　　 目的万古霉素中介金葡菌(VISA)和异质性万古霉素中介金葡菌(h-VISA)通常伴有毒力和生物膜等多个生物学表型特征的改变,这些变化可使细菌在体内长期存活,导致感染反复发作。Vra SR是金葡菌万古霉素耐药相关二元调控系统。有研究显示,vra SR的表达水平在h VISA/VISA中明显上升。通过前期研究,我们发现Vra R蛋白可直接与金葡菌全局调控子agr启动子区域结合,提示Vra SR可能具有广泛的调控作用。本文重点探讨Vra SR在h VISA/VISA致病性中发挥的作用,以期为基于Vra SR的h VISA/VISA感染诊断和临床治疗提供理论依据。方法(1)利用基因敲除及基因回补技术构建异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌标准菌株(Mu3)vra SR基因敲除株(Δvra SR)及基因回补株(CΔvra SR),采用q RT-PCR验证构建是否成功。(2)生物表型研究:用分光光度计检测金黄色葡萄球菌的生长情况,绘制生长曲线;E-test方法检测万古霉素MIC值;稀释法定量检测溶血素活力和凝固酶活力;通过电子显微镜观察细菌细胞壁厚度;与人宫颈癌上皮细胞共培养观察细菌粘附能力;微孔板成膜法和激光共聚焦显微镜法检测细菌的生物膜形成能力;体外中性粒细胞吞噬及杀伤实验检测细菌抗吞噬及抗杀菌能力。q RT-PCR的方法检测粘附相关基因(fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi)、细胞壁合成相关基因(cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D)的转录水平。结果1.成功构建vraSR基因敲除株及其回补株,q RT-PCR证实ΔvraSR中vraSR基因的转录完全缺失,对Δvra SR的质粒回补回复了vra SR基因的转录。2.Mu3中vra SR基因的缺失对金葡菌生物表型的影响:(1)与Mu3相比,Δvra SR对金葡菌的生长未造成明显影响;(2)Mu3、Δvra SR和CΔvra SR万古霉素MIC值分别为1.5μg/ml、0.38μg/ml、1.5μg/ml,与Mu3相比,Δvra SR菌株万古霉素MIC值下降了3.95倍。CΔvra SR株能回复万古霉素的MIC值;(3)Δvra SR与Mu3相比溶血素活力和凝固酶活力无统计学差异(P0.05);(4)Δvra SR菌株细胞壁合成能力下降,Mu3和Δvra SR细胞壁平均厚度分别为18.53±2.84 nm和26.64±3.07nm(p0.01).CΔvra SR株能回复细胞壁合成能力,其细胞壁平均厚度为23.32±3.59 nm(p0.01);(5)与Mu3相比,Δvra SR粘附He La细胞的能力降低(LOG10 CFU/ml,5.75±0.43 Vs 3.53±0.71,p0.01),CΔvra SR能回复对Hela细胞的黏附能力(LOG10CFU/ml5.20±0.36,p0.05)。(6)Δvra SR菌株生物膜合成能力下降,Mu3和Δvra SR生物膜平均厚度分别为7.38±1.4μm Vs 14.44±1.65μm,(p0.001)。CΔvra SR能回复生物膜的合成能力(9.35±1.37μm,p0.01)(7)与Mu3相比,Δvra SR更易被中性粒细胞吞噬和杀伤,Mu3与Δvra SR吞噬率分别为47.75±2.56%和71.29±2.55%(p0.001),吞噬指数分别为1.65±0.16和3.11±0.32(p0.01),在中性粒细胞中细菌的存活量分别为5.56±0.63 Vs 2.73±0.50(LOG10 CFU/ml)(p0.001)。(8)与Mu3相比,Δvra SR菌株中粘附相关基因fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi和细胞壁合成相关基因cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D的转录水平均表现为下调,且差异有显著性(p0.05),CΔvra SR株能回复黏附基因和细胞壁合成相关基因的表达。结论二元调控系统Vra SR在h VISA/VISA致病性中发挥重要作用。Vra SR可以增加金葡菌对万古霉素的耐药,促进金葡菌粘附上皮细胞及合成细胞壁、增强生物膜形成。增强金葡菌抵抗人中性粒细胞的吞噬及杀菌,协助金葡菌逃避人免疫系统的攻击,有利于其在体内的生存。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

3 结果3.1 金葡菌 Mu3 中 vraSR 基因的敲除及回补图1A是Mu3与vraSR基因敲除株ΔvraSR基因组DNA以vraSR-IF和vraSR-IR为引物的 pcr 结果，以 Mu3 为模板，扩增 PCR 产物长度为 1755bp，以 vraSR 基因

图 2 Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR 菌株生长曲线Fig 2. The growth curve of Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR strainsvraSR 基因降低金葡菌对万古霉素耐药显示 Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR 菌株万古霉素 MIC 值分别为 1.5μg、1.5μg/ml。与 Mu3 相比，ΔvraSR 菌株万古霉素 MIC 值下降了 3株能回复万古霉素的 MIC 值。以上结果说明 VraSR 增加金葡菌对。

安徽医科大学硕士学位论文图 3 Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR E-test 结果Fig 3. The MIC of Mu3、ΔvraSR and CΔvraSR strains除 vraSR 基因对金葡菌溶血素活力无明显影响图 4 显示 Mu3 与ΔvraSR 菌株溶血素活力无明显差异（P＞0.05）。该结果raSR 对金葡菌溶血素活力无明显影响。
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1 高彩虹;万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌二元调控系统VraSR在细菌致病性中的作用研究[D];安徽医科大学;2019年

本文编号：2871322