肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌碳青霉烯异质性耐药及机制研究

发布时间：2020-11-10 01:18

　　 目的:异质性耐药(Heteroresistance,HR)是指同一遗传背景下不同克隆亚群对抗生素敏感性各不相同的现象,作为耐药的一种特殊形式,异质性耐药被认为是细菌由敏感状态发展至耐药状态的中间阶段。本研究通过分析肺炎克雷伯菌对头孢吡肟(Cefepime-heteroresistant-Klebsiella pneumoniae,FEP-HR-KP)和厄他培南(Ertapenem-heteroresistant-Klebsiella pneumoniae,ETP-HR-KP)异质性耐药的临床特征、临床转归与独立危险因素,以及大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素异质性耐药(Carbapenem heteroresistanc Escherichia coli,CHEC)的分子机制,为临床治疗提供相关理论依据和防控措施。方法:收集2014年1月至2015年12月从重庆医科大学附属第一医院住院患者无菌体液标本中分离的108株肺炎克雷伯菌进行回顾性病例对照研究,先用纸片扩散法(Kirby-Bauer disk diffusion test,K-B法)和E-test法进行异质性耐药表型的初筛,进而用菌落谱型分析(Population Analysis Profile,PAP法)进行异质性耐药的确证;脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)进行菌株同源性检测及分子流行病学特征分析;统计分析2年内FEP-HR-KP和ETP-HR-KP临床特征,随后统计临床病例资料并运用SPSS.21软件分析FEP-HR-KP和ETP-HR-KP菌感染的相关独立危险因素。另外,针对研究中发现的一个特殊病例,先用K-B法和PAP实验对异质性耐药表型初筛和确认,PCR(Polymerase chain reaction)法检测碳青霉烯耐药相关基因,从体内和体外两个方面比较三株菌毒力大小;用第二代测序技术对三株菌进行全基因组测序,从基因层面阐明了三株菌的相关信息,完成外排泵相关基因SNP突变位点验证。结果:1、肺炎克雷伯菌对头孢吡肟和厄他培南异质性耐药的流行病学及危险因素研究结果如下:(1)K-B法和E-test法发现FEP-HR-KP和ETP-HR-KP并经PAP实验确认。(2)PFGE结果显示,异质性耐药菌株原始菌和克隆亚群的条带一致,没有差异,遗传学上具有高度的同源关系,可认为是相同的菌株;而收集的临床菌株之间的PFGE条带各不相同,两两之间均存在7条条带以上的差异,菌株之间不存在暴发流行。(3)肺炎克雷伯菌对FEP的药敏结果分布情况为:异质性耐药菌株共有51株(51/108,47.2%),敏感菌株共有29株(29/108,26.9%),中介菌株共有3株(3/108,2.8%),耐药菌株共有25株(25/108,23.1%);肺炎克雷伯菌对ETP的药敏结果分布情况为:异质性耐药菌株共有63株(63/108,58.3%),敏感菌株共有16株(16/108,14.8%),中介菌株共有4株(4/108,3.7%),耐药菌株共有25株(25/108,23.2%)。进一步分析从2014年到2015年的整体异质性耐药率,菌株对ETP的异质性耐药率58.3%(63/108)高于FEP的47.2%(51/108),且FEP和ETP的异质性耐药率逐年增加。肺炎克雷伯菌主要分离自血液标本(36/108,33.3%),且超过一半的标本都来自于外科(70/108,64.8%)。(4)危险因素分析结果显示软组织感染(OR:1.92,95%CI:0.91-3.91,P=0.049)、机械通气(OR:2.45,95%CI:1.31-4.47,P=0.013)、头孢菌素类抗生素使用(OR:2.10,95%CI:1.18-3.13,P=0.020)是引起FEP-HR-KP相关感染的独立危险因素(P0.05);头孢类抗生素使用(OR:2.08,95%CI:0.96-4.20,P=0.033)、内置引流管(OR:2.76,95%CI:1.49-4.90,P=0.018)、碳青霉烯类抗生素使用(OR:2.52,95%CI:1.08-3.86,P=0.023)是引起ETP-HR-KP相关感染的独立危险因素(P0.05)。2、大肠埃希菌碳青霉烯异质性耐药机制研究结果如下:(1)统计三株菌的药敏信息,K-B法初筛异质性耐药表型然后用PAP实验确认,证实1001为敏感菌,1021为异质性耐药菌,88为耐药菌。(2)耐药相关基因检测结果显示1001号菌表达bla_(CTX-M-14)基因,1021号菌表达bla_(CTX-M-14)、bla_(CMY-42)基因,88号菌表达bla_(CTX-M-15)、bla_(CMY-42)、bla_(OXA-1)基因,均没有检测出碳青霉烯酶基因和AmpC基因,也没有膜孔蛋白缺失。3株菌在体外和体内的毒力大小结果是一致的,即1021号菌毒力最强,1001号菌其次,88号菌毒力最弱。(3)SNP突变位点验证结果显示异质性耐药菌株在acrA基因上存在D80L(第80位由天冬氨酸变为亮氨酸)和S81Q(第81位由丝氨酸变为谷酰胺)的氨基酸替换现象,marA基因上存在T50W(第50位由苏氨酸变为色氨酸)的氨基酸替换现象,在acrR基因上存在L97E(第97位由亮氨酸变为谷氨酸)的氨基酸替换现象,在soxR基因上存在V57H(第57位由缬氨酸变为组氨酸)的氨基酸替换现象。结论:异质性耐药是耐药的一种特殊形式,普遍存在于各类细菌对各类抗生素的耐药之中。肺炎克雷伯菌对头孢吡肟和厄他培南异质性耐药相关研究结果提示侵入性操作和长期抗生素治疗史会增加患者感染该类异质性耐药菌株的风险,因此,减少不必要的侵入性操作并采用多种抗生素短期结合治疗是防控该类菌株产生的有效措施。另外,目前国内外对于异质性耐药的研究较少,机制尚不清楚,本研究中大肠埃希菌碳青霉烯异质性耐药相关机制可能有以下几种:1、产ESBLs相关基因的表达可能与大肠埃希菌对碳青霉烯异质性耐药有关。2、外排泵相关基因突变可能是CHEC菌株从敏感到异质性耐药最终进化为耐药的机制。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

3.1 异质性耐药菌株的初筛K-B药敏纸片法和E-test实验显示，抑菌圈内有散在的菌落生长，说明各细菌亚群对FEP和ETP敏感程度不一，可初步判定为异质性耐药，见图1.1和图1.2。a b图1.1 肺炎克雷伯菌FEP和ETP的K-B法结果Figure1.1 K-B test result of FEP and ETP in K. pneumoniae

19a b图1.2 肺炎克雷伯菌FEP和ETP的E-test法结果Figure1.2 E-test result of FEP and ETP in K. pneumoniae3.2 异质性耐药菌株的 PAP 确认PAP实验是判断异质性耐药菌株的金标准，如果细菌生长的最高非抑菌抗生素浓度与最低完全抑菌抗生素浓度差异大于8倍，则可以确认为异质性耐药现象。以FEP为例，如图1.2所示：完全敏感菌8010在最低抑菌浓度2μg/ml附近迅速被杀灭，无菌落生长；完全耐药菌8007在药物浓度为128μg/ml之前都保持比较稳定的状态，在最低抑菌浓度曲线突然下降，无菌落生长；而8023、8027、8038、8039、8014这5株异质性耐药菌株的曲线则缓慢下降，且最高非抑菌抗生素浓度与最低完全抑菌抗生素浓度差异大于8倍。a b图1.3 肺炎克雷伯菌FEP和ETP的PAP?

肺炎克雷伯菌FEP和ETP的PAP曲线图
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 孙静娜;董威;赵帅;王国欣;刘泽世;张征;;CCCP泵抑制剂对多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌作用的研究[J];中国卫生检验杂志;2014年21期

2 孙继德;付双双;黄世峰;徐绣宇;张莉萍;;无菌体液中大肠埃希菌对头孢吡肟耐药的危险因素分析[J];第三军医大学学报;2014年19期

本文编号：2877245