基于等温核酸扩增技术检测人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶

发布时间：2020-11-11 05:45

　　 人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)是一种重要的蛋白酶,它可以特异性识别并切除DNA中的脱氧次黄嘌呤和各种烷基化嘌呤。hAAG在维持基因组完整性方面发挥着关键作用,它参与细胞周期调控和细胞凋亡,并且和各种癌症如肺癌和宫颈癌等息息相关。除此之外,hAAG能够诱导产生移码突变和人体细胞中的微卫星不稳定。因此,准确并且灵敏检测hAAG活性对于生物医学研究和临床诊断都至关重要。为了提高检测灵敏度,自20世纪90年代初以来,已开发了多种等温核酸扩增技术,并可用于多种不同目标物的测定,如蛋白质,细胞,小分子和离子等。与聚合酶链式反应(PCR)相比,等温核酸扩增具有快速高效的特点,可在简单条件下(如水浴)进行,在恒定温度下即可实现10~n倍的信号放大,对于低浓度疾病标志物的检测具有重要意义。基于此,本论文在前人工作的基础上,围绕等温核酸扩增技术检测hAAG开展了以下研究内容:第一章:主要介绍了DNA糖苷酶和常用的等温核酸扩增技术,并重点介绍了目前基于等温核酸扩增技术检测DNA糖苷酶的方法。第二章:建立了一种简单的末端转移酶(TdT)激活的-核酸内切酶IV(Endo IV)辅助的超分支信号扩增方法灵敏检测hAAG。该方法极其简单,整个反应只需设计两种核酸序列,反应时间只需要~100 min。采用3'-NH_2修饰的发夹探针和信号探针抑制TdT激活的非特异性扩增,使得反应体系产生低的背景信号,并且结合高效率的超分支扩增技术,该方法具有较高的灵敏度,检测限为0.09032U/mL,线性范围为0.1到50 U/mL,可以达到3个数量级,并可用于复杂HeLa细胞核提取物中hAAG的准确检测。该方法还可用于区分hAAG与其它DNA糖苷酶。第三章:发展了一种基于碱基切除修复调制的三重级联信号扩增方法高灵敏检测DNA糖苷酶。目标物hAAG引发SDA反应,生成的产物作为引物触发PG-RCA与基于Endo IV辅助的循环信号放大反应,利用三重级联信号扩增技术的高效率和UDG糖苷酶调制扩增的低背景,该方法具有高的灵敏度,对于hAAG的测定,检测限低至0.02612 U/mL。此外,该方法也可进一步定量HeLa细胞提取物中hAAG的活性。第四章:建立了一种基于hAAG引发、TdT酶调制的合成CuNPs并无标记检测hAAG活性的荧光方法。TdT酶可以将dTTPs聚合添加到hAAG切割反应产生的具有3'-OH末端的核酸上,形成聚T核酸序列,该序列可以与具有AP位点的辅助模板和辅助探针杂交形成稳定的dsDNA,而Endo IV会切割dsDNA上的AP位点,继续产生具有3'-OH末端的核酸。在TdT酶和Endo IV的共同作用下,整个反应反复循环,最终产生大量的聚T核酸序列。最后,以聚T核酸序列为模板合成具有荧光信号的CuNPs并定量检测hAAG的活性。与之前通过荧光试剂和猝灭剂标记的方法相比,该方法无需标记,成本低,稳定性好,并且具有良好的选择性。第五章:结论。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R440
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 综述
    1.1 前言
    1.2 碱基切除修复反应
    1.3 DNA糖苷酶
    1.4 等温核酸扩增技术
        1.4.1 链置换扩增技术（SDA）
        1.4.2 指数扩增技术（EXPAR）
        1.4.3 滚环扩增技术（RCA）
        1.4.4 杂交链反应（HCR）
        1.4.5 级联放大技术
        1.4.6 等温核酸扩增技术的应用
    1.5 基于等温核酸扩增技术检测DNA糖苷酶
        1.5.1 比色法
        1.5.2 荧光法
        1.5.3 生物发光法
        1.5.4 电化学法
    1.6 选题思路和主要研究内容
第二章 靶向调制的超支化扩增检测HeLa细胞中的人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    2.1 前言
    2.2 实验部分
        2.2.1 试剂和材料
        2.2.2 hAAG活性检测方法
        2.2.3 凝胶电泳分析
        2.2.4 细胞培养和细胞核提取物的制备
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 设计原理
        2.3.2 可行性分析
        2.3.3 条件优化
        2.3.4 hAAG活性分析
        2.3.5 选择性分析
        2.3.6 实际样品分析
    2.4 结论
第三章 碱基切除修复调制的三重级联信号扩增高灵敏检测人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    3.1 前言
    3.2 实验部分
        3.2.1 试剂和材料
        3.2.2 DNA储备液的制备
        3.2.3 hAAG活性检测方法
        3.2.4 凝胶电泳分析
        3.2.5 细胞培养和细胞核提取物的制备
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 设计原理
        3.3.2 可行性分析
        3.3.3 条件的优化
        3.3.4 hAAG活性分析
        3.3.5 选择性分析
        3.3.6 实际样品分析
    3.4 结论
第四章 基于目标物引发的荧光CuNPs的合成无标记检测人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    4.1 前言
    4.2 实验部分
        4.2.1 试剂和材料
        4.2.2 DNA储备液的制备
        4.2.3 hAAG活性检测方法
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 设计原理
        4.3.2 可行性分析
        4.3.3 条件优化
        4.3.4 hAAG活性分析
        4.3.5 选择性分析
    4.4 结论
第五章 结论
参考文献
在学期间的研究成果
致谢

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