人腺病毒三重实时荧光定量PCR方法的建立及非肠道腺病毒与儿童腹泻关系的初步研究
发布时间：2020-11-11 14:57
第一部分建立三重实时荧光定量PCR方法检测人腺病毒2,3,7型目的:建立三重实时荧光定量PCR(qPCR)方法,实现单管一次同时检测人腺病毒(HAdV)2,3,7型,为临床实验室检测HAdV 2,3,7型提供快速、便捷的分子诊断方法。方法:(1)首先从GenBank中下载HAdV全基因组序列和2型3型7型的Hexon基因序列。(2)从已报道文献中找到HAdV分型通用引物,通过Vector NTI比对HAdV全基因组序列和2,3,7型Hexon基因序列,找到包括HAdV 2,3,7型保守区,在保持已报道通用上游引物不变的同时,用oligo7.0重新设计下游引物以达到实时荧光定量PCR对产物长度的要求。(3)通过以上的比对结果,找到2,3,7型不同区域分别设计探针。(4)对PCR引物和探针浓度,退火温度,灵敏度特异性进行验证分析。(5)采用已建立的多重qPCR方法检测138份HAdV阳性临床标本,并用巢氏PCR方法测序分型验证。结果:本研究成功的建立了一种三重检测HAdV2,3,7型的qPCR方法,该方法的灵敏度是每反应100拷贝含目的片段的重组质粒。该检测方法的特异性良好,不与常见呼吸道病原体和非HAdV2,3,7型的其它血清型发生交叉反应。该方法的组内差异和组间差异分别是0.6%和3.6%。该方法和巢氏PCR测序方法同时检测138份HAdV阳性临床标本的一致性是96.38%(133/138)。结论:本研究建立的三重qPCR方法能够快速、便捷、准确的实现单管同时检测HAdV 2,3,7型,且具有潜在的临床应用价值。第二部分非肠道腺病毒与儿童腹泻关系的研究目的:肠道腺病毒40,41型现已证实会引起腹泻的发生,关于非肠道腺病毒和腹泻的关系还没有确切的结论,部分研究表明能在腹泻标本中检测到非肠道腺病毒散发存在。本研究旨在运用病例-对照研究方法探讨非肠道腺病毒与腹泻发生的关系。方法:收集河北省儿童医院腹泻患儿粪便标本273份,外科住院且近半月无腹泻病史儿童粪便标本361份。运用实时荧光定量PCR(qPCR)方法对634份临床标本进行腺病毒(HAdV)筛查并通过建立标准曲线对阳性标本进行定量,同时对HAdV阳性标本进行巢氏PCR扩增后测序分型。并且对腹泻组非肠道腺病毒阳性标本进行常见腹泻相关病原普筛查,排除其他腹泻相关病原普干扰。通过比值比(OR)计算HAdV各血清型发生腹泻的危险因素。结果:HAdV在腹泻组中的阳性检出率是28.94%(79/273)其中包括血清型40,41,3,2,1,5和57型,以40,41和3型最为多见。对照组儿童中HAdV的阳性检出率是7.20%(26/361)主要包括血清型40,41,3,2,1,5,57,6和31型。其中HAdV阳性腹泻组中小于3岁的患儿占91.14%,对照组占65.38%。肠道腺病毒41型病毒载量在两组人群中无明显差异(Z=-0.157,P=0.875)。非肠道腺病毒3型是儿童发生腹泻的危险因素(OR=9.205,P0.001)。结论:感染HAdV 3型患儿可能会引起腹泻的发生。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R725.1;R440
【部分图文】：
图 1 三重 qPCR 方法检测 HAdV2，3，7 型灵敏度结果及标准曲线的建立。Fig.1 Sensitivity of triple qPCR for detection of HAdV2, 3, 7 andestablishment of standard curve. A (HAdV 2 sensitivity result) B (HAdV 3Sensitivity result) C (HAdV 7 sensitivity result) D (HAdV 2, 3, 7 standardcurve).
图 2 模拟 HAdV 2，3，7 血清型三重感染灵敏度结果及标准曲线的建立。Fig.2 Simulated sensitivity of HAdV type 2, 3, 7 triple infection andestablishment of standard curve. The left figure shows the sensitivity ofHAdV type 2, 3 and 7, while the right figure shows the standard curve.4 三重 qPCR 方法特异性结果将人鼻病毒、副流感病毒、人博卡病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、人偏肺病毒、支原体和衣原体以及 HAdV A (31), B (55), C (1,5,6), E (4)等血清型用于三重 qPCR 方法特异性的评估，结果显示本方法与其他常见呼吸道病原体以及 HAdV A (31), B (55), C (1,5,6), E (4)等无交叉反应，结果如图 3 所示。
图 3 三重 qPCR 方法特异性结果图Fig. 3 Specific results of triple qPCR qPCR 方法重复性结果目的片段的 HAdV 2，3，7 型质粒作为模板，运用三重 qPCR 107、105、103copy/μL 的质粒进行检测，检测结果显示该方异系数在 0.6-3.6，组间变异系数为 1.0-3.6，具有良好的重复 7 表 8。表 7 三重 qPCR 方法批内重复数据e 7 Intra-assay of coefficient of variation(CV) of the tq-PCR.107copy/μl 105copy/μl 103copy/μl
【参考文献】
本文编号：2879339
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R725.1;R440
【部分图文】：
图 1 三重 qPCR 方法检测 HAdV2，3，7 型灵敏度结果及标准曲线的建立。Fig.1 Sensitivity of triple qPCR for detection of HAdV2, 3, 7 andestablishment of standard curve. A (HAdV 2 sensitivity result) B (HAdV 3Sensitivity result) C (HAdV 7 sensitivity result) D (HAdV 2, 3, 7 standardcurve).
图 2 模拟 HAdV 2，3，7 血清型三重感染灵敏度结果及标准曲线的建立。Fig.2 Simulated sensitivity of HAdV type 2, 3, 7 triple infection andestablishment of standard curve. The left figure shows the sensitivity ofHAdV type 2, 3 and 7, while the right figure shows the standard curve.4 三重 qPCR 方法特异性结果将人鼻病毒、副流感病毒、人博卡病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、人偏肺病毒、支原体和衣原体以及 HAdV A (31), B (55), C (1,5,6), E (4)等血清型用于三重 qPCR 方法特异性的评估，结果显示本方法与其他常见呼吸道病原体以及 HAdV A (31), B (55), C (1,5,6), E (4)等无交叉反应，结果如图 3 所示。
图 3 三重 qPCR 方法特异性结果图Fig. 3 Specific results of triple qPCR qPCR 方法重复性结果目的片段的 HAdV 2，3，7 型质粒作为模板，运用三重 qPCR 107、105、103copy/μL 的质粒进行检测，检测结果显示该方异系数在 0.6-3.6，组间变异系数为 1.0-3.6，具有良好的重复 7 表 8。表 7 三重 qPCR 方法批内重复数据e 7 Intra-assay of coefficient of variation(CV) of the tq-PCR.107copy/μl 105copy/μl 103copy/μl
【参考文献】
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本文编号：2879339
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