以细菌磁小体为载体携带凋亡素—天蚕素基因进行肝癌治疗的研究

发布时间：2020-11-21 13:15

　　 肝癌严重威胁着人类健康乃至生命。目前,癌症的主要治疗手段如外科手术、放疗及化疗等都存在着局限性和不确定性。基因治疗技术的出现为癌症的治疗展现出良好的应用前景。基因治疗过程中所用到的载体主要有两种:病毒载体和非病毒载体。前者具有很高的转染效率,但它们可能会引起机体强烈的免疫反应甚或发生基因整合而再次引发细胞癌变,极大的限制了它们在临床上的应用。而后者具有较高的生物安全性,但存在转染效率低下的问题。近年来,研究者们发现细菌磁小体(Bacterial magnetic particle,BMP)是一个优良的基因转移载体,它不仅有较高的基因转移效率,而且具有生物相容性和生物安全性等优点,为其应用于基因治疗奠定了基础。本研究将凋亡素(Chicken anemia virus protein 3,VP3)-天蚕素(Antibacterial peptides,ABPs)基因克隆到基因治疗的真核载体pVAX1中(BMP-pVAX1-VP3-ABPs,pVAX1-VA),在细胞水平和机体水平研究以BMP作为基因转移载体在肝癌基因治疗中的可行性,并研究共表达VP3-ABPs的目的基因表达质粒pVAX1-VA对人类肝癌治疗的有效性和安全性。在细胞实验中,本研究首先确定BMP-DNA复合物的连接体系,证明以浓度为2mg/mL的PEI作为偶联剂,BMP、PEI和DNA质量比为1:1.6:0.8时制备的BMP-DNA复合物具有最佳的基因转染效率。通过透射电镜、zeta电位和水合粒径等分析BMP-DNA复合物,结果显示BMP连接目的基因前、后在大小、形状等方面没有明显改变,可以有效的递送并保证目的基因在细胞内表达。其次,本研究探索了以BMP作为基因载体携带含有绿色荧光蛋白的目的基因表达质粒pIRES2-EGFP-VP3-ABPs(pIRES2-VA)在人的肿瘤细胞HepG2、HeLa以及人的正常肝细胞HL7702中的基因递送效率,结果显示相比于PEI和Lipofectamine 2000,BMP具有更高的基因转染效率,且在肿瘤细胞中的转染效率显著高于正常细胞。MTT实验进一步证实,以BMP为载体递送目的基因表达质粒pVAX1-VA对癌细胞具有一定的选择性杀伤作用。随后,本研究分析了共表达VP3和ABPs的目的基因表达质粒pVAX1-VA在HepG2和HL7702细胞中诱导细胞凋亡的作用机制。Hochest33342、annexin-V/7-AAD、细胞周期、细胞线粒体膜电位以及caspase家族基因等实验结果显示,相比于Lipofectamine2000,以BMP作为基因载体携带目的基因表达质粒pVAX1-VA进入HepG2细胞后,会进一步降低细胞线粒体膜电位、上调caspase-3和caspase-9的表达而显著诱导细胞凋亡。而且,与单独表达VP3或ABPs基因相比,共表达VP3-ABPs基因显著提高了其作用效果。此外,目的基因对正常细胞的作用效果不明显,也表明以BMP作为基因载体携带目的基因表达质粒pVAX1-VA可以选择性的诱导肿瘤细胞发生凋亡。最后,本研究构建了 BALB/c雌性裸鼠皮下肿瘤模型,以BMP作为基因载体携带目的基因表达质粒pVAX1-VA,并在治疗剂量分别为1、3、5、10和20 μg时检测目的基因在体内的抗肿瘤效应。结果显示pVAX1-VA在体内可以有效的抑制肿瘤生长,在剂量为5 μg时治疗效果最明显,抑瘤率可达51%,更高剂量的治疗效果未明显提高。此外,以BMP作为基因载体递送目的基因表达质粒pVAX1-VA的抗肿瘤效果比以Lipofectamine2000为载体是显著提高。对小鼠肿瘤和主要组织器官进行HE染色,观察到BMP-pVAX1-VA治疗组小鼠的肿瘤组织周围有大量的肿瘤浸润性淋巴细胞,而心、肝、脾、肺和肾等主要器官没有显示出明显的组织病变。表明以BMP为载体在体内递送目的基因表达质粒pVAX1-VA具有良好的抗肿瘤效果,且对机体主要脏器毒副作用较小。综上所述,BMP是一种高效且相对安全的基因传递载体,并首次在细胞和机体水平上证实,以BMP为载体携带共表达VP3和ABPs基因的表达质粒pVAX1-VA对肝癌具有良好的治疗效果,且其比单独表达VP3或ABPs基因时具有更高的疗效。为恶性肿瘤的基因治疗提供了新的理论依据和技术手段。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7;R450
【部分图文】：

组中存在一类处于静息状态的基因，被称为原癌基因，这类基因起重要的调控作用。在致癌因素的影响下，原癌基因的结构和为促进细胞恶性转化的癌基因（Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕｅｔａｌ．，?２００５），从有一类与原癌基因相对的，对细胞增殖起负调控作用的基因，会抑制细胞生长、诱导受损细胞发生凋亡，如果抑癌基因的功转化（Ｉｎｏｕｅｅｔａｌ．，２０１６）。??们认为癌细胞是由体细胞发生突变而来，但随着肿瘤发生的分子现了大量有悖于体细胞突变学说的实验结果，即并非所有肿瘤能是由干细胞或者造血祖细胞这类具有很强增殖和分化能力表型的改变（Ｄｏｎｔｕ?ｅｔ?ａｌ．，?２００３）。诸多证据表明，人类癌症的发由于机体基因的改变，使正常的细胞进一步转化为高度恶性的癌基因与抑癌基因致癌突变的积累。研究者对多种类型的癌症中有多个位点发生了突变，这与达尔文进化论过程类似，在这的基因变化，而每一种变化都会赋予细胞一种生长优势，从而促（Ｈａｎａｈａｎ?ａｎｄ?Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，?２０１１）。??

的目的仍是基因治疗的难点和热点。??１．３．２基因治疗中的基因转移技术??外源基因的转移通常有五个步骤（图１－４）：〗）外源基因与细胞膜接触；２）细胞通过内??吞作用将外源基因吞入进入溶酶体；３）外源基因从溶酶体中出来进入细胞质；４）外源基因??进入细胞核；５）外源基因在细胞核内表达，发挥免疫学功能（ＷａｇｎｅｒａｎｄＫｌ〇ｅｃｋｎｅｒ，２００６ｈ??一个有效的基因转移系统决定了遗传物质进入细胞的效率和持续发挥治疗作用的时间，也??是所有基因治疗的基础。??／〇＼?Ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ??＇?＇?ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ??一??Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ?＾??ｉ?ｒ＼（３）??⑥名）少＇：＿（５厂：：乂＇吵??Ｃ＾ｏｓｏｌ?／／?Ｎｕｃｌｅｕｓ?ｕｎｐｏｒｔ?＼＼??图１￣４．外源基因转染示意图（Ｗａｇｎｅｒ?ａｎｄ?Ｋｌｏｅｃｋｎｅｒ，?２００６）??外源基因转移的五个步骤：１）外源基因与细胞膜接触；２）细胞通过内吞作用将外源基因吞入进入溶酶体；??３）外源基因从溶酶体中出来进入细胞质；句外源基因进入细胞核；５）外源基因在细胞核内表达，发挥免疫??学功能。??目前，基因转移的载体可分为两类：病毒和非病毒。病毒载体，是通过改造病毒的基因??组，使其携带外源基因并包装成完整的病毒颗粒。这类载体以病毒感染的方式将基因传递到??细胞内部，转染和表达效率都较高。但是，病毒载体在构建和纯化方面比较困难，而且存在??如包装容量有限、插入突变、基因重组及免疫反应等一系列安全隐患。因此

能检测到ＦｅＳ和ＦｅＳ２的存在（Ｂａｚｙｌｉｎｓｋｉ?ｅｔ?ａｌ．，１９９５）。每个细菌细胞内约有１０－３０个成熟的??磁小体，直径在３５－１２０?ｎｍ之间，处于稳定的单磁畴晶体范围内（Ｂａｚｙｌｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，１９９４）。晶??体的形态结构主要有棱柱形、正八面体形、子弹状、液滴状、薄片状以及球状等（图１－９）。??２０??
【参考文献】

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1 邓宏;中医药综合治疗中晚期肝癌的疗效及预后因子分析[D];广州中医药大学;2002年

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本文编号：2893054