HPV16型L1蛋白优势表位原核表达及其血清学验证
发布时间：2020-12-03 09:50
目的利用原核系统对人乳头瘤病毒（HPV）16型L1蛋白优势抗原表位进行重组表达与纯化,并检测血清学反应。方法对HPV16型L1蛋白优势抗原表位进行全基因合成,将核酸片段克隆至pET-DsbC原核表达载体,重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta（DE3）,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,采用亲和层析对表达产物进行纯化,采用免疫印迹法、酶联免疫吸附试验（ELISA）验证重组蛋白的免疫学活性。结果成功构建了pET-DsbC-HPV16 L1表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta（DE3）中实现了稳定的可溶性表达。重组DsbC-HPV16 L1蛋白经亲和层析进行纯化,相对分子质量为45 000,纯度为95%,重组蛋白纯化得率为22%。免疫印迹法结果显示,重组DsbC-HPV16 L1蛋白可与HPV16型阳性血清产生特异的抗原-抗体反应,与重组DsbC蛋白或健康人血清无交叉反应,具有良好的特异性。ELISA结果显示,重组DsbC-HPV16 L1蛋白与HPV16型阳性血清有较强的免疫反应性,A450 nm均值为0.56,高于健康人血清和磷酸盐缓冲液（PBS）阴性对照（A450n...
【文章来源】：检验医学. 2020年09期 第928-932页
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
HPV16 L1 C端核酸PCR鉴定凝胶电泳结果
Dsb C-HPV16 L1融合表达载体经转化大肠埃希菌Rosetta(DE3）宿主菌后以IPTG诱导，可获得目的蛋白的原核表达，冰浴超声破碎后进行SDS-PAGE。结果显示，在目的相对分子质量46 000处（Dsb C蛋白为28 000）有明显的蛋白表达，目的蛋白占菌体蛋白的30%以上。超声破碎后的上清液中可溶目的蛋白占表达蛋白的50%以上。见图2。超声破碎后的上清液以亲和层析纯化，150 mmol/L咪唑洗脱获得的纯化融合蛋白经SDS-PAGE分析，纯度为95%，见图3。采用BCA蛋白定量法（重组蛋白纯化得率=纯化后的目的蛋白/上样前上清液总蛋白×50%）计算得重组蛋白纯化得率为22%。
超声破碎后的上清液以亲和层析纯化，150 mmol/L咪唑洗脱获得的纯化融合蛋白经SDS-PAGE分析，纯度为95%，见图3。采用BCA蛋白定量法（重组蛋白纯化得率=纯化后的目的蛋白/上样前上清液总蛋白×50%）计算得重组蛋白纯化得率为22%。2.3 重组融合蛋白抗原性的免疫印迹法结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]人乳头瘤病毒16型L1蛋白B细胞表位预测[J]. 王爱萍,蒋敏,栗宁,张改平,祁艳华,刘燕凯,席宇,周景明. 细胞与分子免疫学杂志. 2016(04)
[2]人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用[J]. 孙卫国,孙雯娜,侯江厚,杨秉芬,张灵霞. 现代检验医学杂志. 2015 (05)
[3]A型肉毒毒素(BoNT/A)表位多肽单克隆抗体的制备及其效价评定[J]. 韦耀,韩朋,周旋,孙琦,张宝,万成松. 中国卫生检验杂志. 2013(18)
[4]Construction of Prophylactic Human Papillomavirus Type 16 L1 Capsid Protein Vaccine Delivered by Live Attenuated Shigella flexneri Strain sh42[J]. Xiao-Feng YANG Xin-Zhong QU Kai WANG Jin ZHENG L(?)-Sheng SI Xiao-Ping DONG Yi-Li WANG Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education,Institute for Cancer Research,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061.China;National Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100052,China;Department of Obstetrics and Gynecology,First Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(11)
[5]宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析[J]. 谷鸿喜,凌虹,张凤民,钟照华,王文阁,郭淑元,娄阁,郭彩玲. 中华实验和临床病毒学杂志. 1999(01)
本文编号：2896272
【文章来源】：检验医学. 2020年09期 第928-932页
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
HPV16 L1 C端核酸PCR鉴定凝胶电泳结果
Dsb C-HPV16 L1融合表达载体经转化大肠埃希菌Rosetta(DE3）宿主菌后以IPTG诱导，可获得目的蛋白的原核表达，冰浴超声破碎后进行SDS-PAGE。结果显示，在目的相对分子质量46 000处（Dsb C蛋白为28 000）有明显的蛋白表达，目的蛋白占菌体蛋白的30%以上。超声破碎后的上清液中可溶目的蛋白占表达蛋白的50%以上。见图2。超声破碎后的上清液以亲和层析纯化，150 mmol/L咪唑洗脱获得的纯化融合蛋白经SDS-PAGE分析，纯度为95%，见图3。采用BCA蛋白定量法（重组蛋白纯化得率=纯化后的目的蛋白/上样前上清液总蛋白×50%）计算得重组蛋白纯化得率为22%。
超声破碎后的上清液以亲和层析纯化，150 mmol/L咪唑洗脱获得的纯化融合蛋白经SDS-PAGE分析，纯度为95%，见图3。采用BCA蛋白定量法（重组蛋白纯化得率=纯化后的目的蛋白/上样前上清液总蛋白×50%）计算得重组蛋白纯化得率为22%。2.3 重组融合蛋白抗原性的免疫印迹法结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]人乳头瘤病毒16型L1蛋白B细胞表位预测[J]. 王爱萍,蒋敏,栗宁,张改平,祁艳华,刘燕凯,席宇,周景明. 细胞与分子免疫学杂志. 2016(04)
[2]人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用[J]. 孙卫国,孙雯娜,侯江厚,杨秉芬,张灵霞. 现代检验医学杂志. 2015 (05)
[3]A型肉毒毒素(BoNT/A)表位多肽单克隆抗体的制备及其效价评定[J]. 韦耀,韩朋,周旋,孙琦,张宝,万成松. 中国卫生检验杂志. 2013(18)
[4]Construction of Prophylactic Human Papillomavirus Type 16 L1 Capsid Protein Vaccine Delivered by Live Attenuated Shigella flexneri Strain sh42[J]. Xiao-Feng YANG Xin-Zhong QU Kai WANG Jin ZHENG L(?)-Sheng SI Xiao-Ping DONG Yi-Li WANG Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education,Institute for Cancer Research,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061.China;National Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100052,China;Department of Obstetrics and Gynecology,First Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(11)
[5]宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析[J]. 谷鸿喜,凌虹,张凤民,钟照华,王文阁,郭淑元,娄阁,郭彩玲. 中华实验和临床病毒学杂志. 1999(01)
本文编号：2896272
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