白变蓝克隆形成实验对CRISPR/Cas9基因编辑效率的评估及应用

发布时间：2024-02-29 22:56

　　第一部分白变蓝克隆形成实验对CRISPR/Cas9 AHI1基因编辑效率的应用与验证目的:CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的高低受到多种因素影响,其中不同sg RNA序列对CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的影响尤为重要。目前,评估不同sg RNA编辑效率高低的方法有多种,本课题的目的是检验白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系是否也能用于CRISPR/Cas9系统不同sg RNA编辑效率的评估,并筛选出针对AHI1基因的最优编辑效率的sg RNA,为今后可能的针对该基因的基因治疗提供参考。方法:本课题研究的白变蓝克隆形成实验应用经典的蓝白筛选原理,首先,p MD-19T质粒上编码β-gal区域的部分序列被一段含有靶序列的长序列替换,从而形成移码突变,替换后的质粒称为p MD-repeat质粒,单独转化在含有X-gal和IPTG的固体培养基中不能形成蓝色菌落;当与装载有靶序列对应sg RNA的p Cas9质粒共转化时,p MD-repeat质粒中靶序列会被sg RNA引导的Cas9蛋白酶切,靶序列前后两段重复序列发生同源重组,使编码β-gal的基因序列由移码恢复为非移码状态,在X...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1pCas9质粒的sgRNA克隆示意图

隆形成实验对CRISPR/Cas9基因编辑效率的评估及应用表1选取的4条AHI1sgRNA序列sgRNA序列sgRNA15'-CTCGGATAATGTCTCCGCGATGGsgRNA25'-GATAATGTCTCCGCGATGGATGGsgRNA35'-....

图2pMD-repeat质粒lacZ基因部分碱基序列（红框代表HIV重复序列；黑框代表

图2pMD-repeat质粒lacZ基因部分碱基序列（红框代表HIV重复序列；黑框代表靶序列；红框与黑框之间是KpnI和HindIII酶切位点）2.3.1pMD-repeat质粒酶切、胶纯化回收pMD-repeat质粒中含有的长序列包含有KpnI和HindIII酶切位点，在重....

图3pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒图谱

图3pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒图谱(BB)-2A-GFP质粒酶切、胶纯化回收-2A-GFP质粒酶切体系见表9；酶切后产物经琼脂表9pSpCas9(BB)-2A-GFP载体酶切体系组分体积as9(BB)-2A-GFP质粒2μBbsI酶（NEB）2μ0....

图4白变蓝克隆形成实验原理示意图

双链的断裂，两段重复序列之间会发生同源重组，仅仅只有一条重复序列会存在lacZ基因的阅读框，由移码状态变成非移码状态，在X-gal和IPTG诱导下，形成蓝色菌落。（实验原理示意图见图4）图4白变蓝克隆形成实验原理示意图2.5.1共转化实验含有sgRNA序列的pCas9质粒和含....

本文编号：3915052