布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2017-06-12 02:00

  本文关键词：布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:布鲁氏菌病作为一种人畜共患病,严重威胁着环境及人类身体健康,建立一种快速、可靠的布鲁氏菌检测方法,对其预防及诊断都具有重要意义。而荧光定量PCR检测技术是一种公认的简单、灵敏、快速的检测方法。但是,在诸多布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的报道中,人们没有意识到抑制物的存在将影响本方法用于样品检测的准确性及可靠性。因此本文建立了一种含两种内参基因的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,在快速、灵敏的检测布鲁氏菌的同时,质控样品DNA及PCR检测过程,提高检测结果的可靠性及准确度。方法:以哺乳动物beta-actin基因为内源性内参基因,质控样本DNA;以重组质粒为外源性内参基因,质控PCR扩增过程。针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,优化布鲁氏菌引物浓度、探针及反应温度,并验证其敏感性、特异性及稳定性,做标准曲线。将该方法用于样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。之后,将阳性样品进行布鲁氏菌的SNP基因分型。结果:1)确立了将哺乳动物的beta-actin基因作为内源内参基因,并设计出特异性引物及探针。用于质控样品DNA提取物;选取大西洋鲑鱼β-球蛋白基因片段,建立了外源重组质粒作为外源性内参,用于质控PCR扩增。2)建立并优化了布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。建立布鲁氏菌标准品,制作标准曲线:只扩增布鲁氏菌DNA时,相关系数R2为0.999(Y=-3.34X+42.85);扩增布鲁氏菌和外源重组质粒时,相关系数R2为0.997(Y=-3.13X+40.50);同时扩增布鲁氏菌及内外源性内参基因时,相关系数R2为0.997(Y=-3.12X+40.9)。说明加入的外源及内源内参基因对布菌检测没有太大影响。本检测方法的检测线达5.6拷贝·μL-1,在特异性检测中,布鲁氏菌引物及探针只扩增了六种经典布鲁氏菌,对阴性参考菌均无非特异性扩增。而且,本检测方法稳定性良好。3)将本方法用于样本检测,共检测了30份动物组织样品,360份动物全血,91份奶样,其中检测出7份布鲁氏菌阳性组织样品,12份布鲁氏菌阳性血样及3份布鲁氏菌阳性奶样。4)查找布鲁氏菌羊种3型以及布鲁氏菌疫苗株A19/S19及Rev.1的SNP位点用于基因分型,并设计出特异性引物及探针。结论:本实验建立了一种可以直接应用于样品检测,含有两种内参基因的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,并能够快速、灵敏、可靠的检测出样品中的布鲁氏菌。并将阳性样品进行进一步的布鲁氏菌SNP基因分型。
【关键词】：布鲁氏菌 内参基因 荧光定量PCR SNP基因分型
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440;R516.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 绪论11-23
• 1.1 布鲁氏菌简介11-12
• 1.2 人患布病12-13
• 1.2.1 人间布病情况12
• 1.2.2 人患布病发病机制12-13
• 1.2.3 人患布病的防治13
• 1.3 布鲁氏菌病的细菌学检测方法13-14
• 1.4 用于布鲁氏菌检测的PCR方法14-20
• 1.4.1 布鲁氏菌DNA的提取14-15
• 1.4.2 单引物PCR技术15-16
• 1.4.3 多重PCR技术16
• 1.4.4 荧光PCR技术16-19
• 1.4.5 其他PCR方法19-20
• 1.5 内参基因的重要性20-21
• 1.6 单核苷酸多态性（SNP）21-23
• 2 布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立23-41
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 实验用菌23
• 2.1.2 实验用试剂23
• 2.1.3 试验用仪器23-24
• 2.1.4 实验用探针及引物24
• 2.2 实验方法24-29
• 2.2.1 感受态细胞的制备24-25
• 2.2.2 细菌DNA的提取25
• 2.2.3 布鲁氏菌属标准品的制备25-27
• 2.2.4 外源性内参重组质粒的制备27-28
• 2.2.5 荧光定量PCR反应体系的优化28
• 2.2.6 多重荧光定量PCR反应体系的建立28
• 2.2.7 荧光定量PCR标准曲线的制备28-29
• 2.2.8 多重荧光定量PCR方法灵敏性、特异性及重复性检测29
• 2.3 实验结果29-37
• 2.3.1 标准品的制备29-31
• 2.3.2 内源性内参基因引物特异性验证31-32
• 2.3.3 布鲁氏菌荧光定量PCR反应条件的优化32-35
• 2.3.4 标准曲线的制备35
• 2.3.5 灵敏性35-36
• 2.3.6 特异性36-37
• 2.3.7 重复性37
• 2.4 讨论37-41
• 3 荧光定量PCR方法用于样品检测41-47
• 3.1 实验材料41-42
• 3.1.1 实验用试剂41
• 3.1.2 实验用仪器41
• 3.1.3 病料来源41-42
• 3.2 实验方法42-43
• 3.2.1 细菌分离培养42
• 3.2.2 病料DNA的提取42-43
• 3.2.3 临床样品的荧光定量PCR检测43
• 3.3 实验结果43-45
• 3.3.1 细菌分离培养检测结果43
• 3.3.2 荧光定量PCR检测结果43-45
• 3.4 讨论45-47
• 4 布鲁氏菌荧光定量PCR单核苷酸多态性分型方法的建立47-57
• 4.1 实验材料47-48
• 4.1.1 实验用菌株47
• 4.1.2 实验用试剂47
• 4.1.3 实验用仪器47-48
• 4.2 方法48-49
• 4.2.1 单核苷酸多态性位点的筛选48
• 4.2.2 布鲁氏菌荧光定量PCR单核苷酸多态性基因48-49
• 4.3 实验结果49-55
• 4.3.1 布鲁氏菌bp26基因序列比对49-51
• 4.3.2 引物及探针的设计51
• 4.3.3 标准品建立51-52
• 4.3.4 引物温度优化52-53
• 4.3.5 引物及探针浓度53-54
• 4.3.6 特异性检测54
• 4.3.7 灵敏性检测54
• 4.3.8 重现性检测54-55
• 4.4 讨论55-57
• 5 结论57-59
• 5.1 总结57-58
• 5.2 展望58-59
• 参考文献59-65
• 致谢65-66
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果66

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本文编号：442932