利用染色体基因组上多拷贝16S rRNA基因鉴定耶尔森菌属细菌的研究

发布时间：2017-09-02 14:37

  本文关键词：利用染色体基因组上多拷贝16S rRNA基因鉴定耶尔森菌属细菌的研究

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【摘要】：目的API20E生化鉴定系统是肠杆菌科细菌鉴定的金标准,但在耶尔森菌鉴定中,API20E生化鉴定试剂条所能鉴定的耶尔森菌种类有限,除鉴定的结果不稳定外,不同种耶尔森菌还会出现相同的代谢谱,如弗氏耶尔森菌和中间型耶尔森菌具有相同的API20E生化编码,因此还需要多种分子生物学方法作为辅助加以鉴别。16S rRNA(小核糖体RNA)基因常用于原核生物种属的分类及鉴定。但16S rRNA基因在原核生物中为多拷贝基因,且不同拷贝之间存在异质性,使用单一拷贝16S rRNA基因进行物种鉴定会出现鉴定错误的情况。因此,我们欲通过结合耶尔森菌属细菌内多个拷贝的16S rRNA基因信息,探讨不同种耶尔森菌不同拷贝间的异质性及对系统发育鉴定的影响。方法本次研究从本实验室选取744株耶尔森菌属细菌,通过T载体克隆的方法,对每株菌随机挑选5个16S rRNA基因克隆子,通过测序技术得到基因序列。对24株来自NCBI的全基因组测序株,采用用随机数字表法,分别选取5条16S rRNA基因信息。然后结合所有菌株内5个16S rRNA基因信息,对768株菌建立系统发育树,分析耶尔森菌属细菌的分类情况。结果本研究共涵盖了768株耶尔森菌属细菌,共10个种,每株菌得到5条16S rRNA基因信息,所有菌株共3840条16S rRNA基因序列,按照一个碱基不同视为不同类型16SrRNA基因序列,共分为439个型别。分析每株菌的5个克隆子所包含的16S rRNA基因类型数发现,60%菌株包括2-3个16SrRNA基因类型,18%菌株包括4个类型,17%的菌株只有1种16S rRNA类型,而五个克隆子均为不同类型的菌株所占比例最少,为5%；比较五种耶尔森菌种间菌株内16S rRNA基因种类,可以看出假结核耶尔森菌、克氏耶尔森菌种内16S rRNA基因类型集中在I-2种,弗氏／中间型耶尔森集中在2-4种,非致病性小肠结肠炎耶尔森菌16S rRNA基因类型集中在2-3种,致病小肠结肠炎耶尔森菌则集中在1-3种。5个克隆子全为同一类型的比例,在致病性小肠耶尔森菌为23.5%,非致病性小肠耶尔森菌仅为8.6%。在鼠疫耶尔森与假结核耶尔森中没有发现5个克隆子均为不同种类型16S rRNA基因的菌株；比较耶尔森菌属细菌内多个拷贝16S rRNA基因相似性发现,同一菌株的5个拷贝16S rRNA基因相似度大部分在99%以上,有9株差异较大,低于98.7%。综合菌株5条16S rRNA基因序列构建系统发育树发现,耶尔森菌种间的聚类结果基本与生化鉴定结果相符,大部分耶尔森菌能形成相应种内聚类群；使用此方法亦能区分用生化反应鉴定难以区分的弗氏耶尔森菌与中间型耶尔森菌；同时也发现有个别克氏耶尔森菌由于种内变异度高,有种间交叉聚类现象,但并不影响鉴定的整体趋势。同时发现,每种菌有其优势序列,部分种间有完全一致的16S rRNA基因序列。结论1、耶尔森菌属细菌16S rRNA基因为多拷贝基因,大部分菌株不同拷贝间序列并不相同,个别菌株超过16S rRNA基因细菌鉴定阈值鉴,使用单个16S rRNA基因进行种类鉴定出现错误的机率会很大。2、通过综合多个16S rRNA基因信息进行耶尔森菌种类鉴定,能够在一定程度上提高耶尔森菌种间的鉴别力。3、拥有相同的16S rRNA基因的不同种耶尔森菌,在细菌鉴定时还需结合其他鉴定方法。
【关键词】：耶尔森菌 16S rRNA基因 多拷贝 系统发育
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R516;R440
【目录】：

• 英文缩写对照表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 引言10-16
• 1. 实验材料与方法16-28
• 1.1 实验仪器与材料16-18
• 1.1.1 实验仪器16-17
• 1.1.2 主要生化试剂17
• 1.1.3 培养基与试剂配制17-18
• 1.2 参考菌株及参考序列来源18-19
• 1.3 实验方法19-28
• 1.3.1 标本采集19-20
• 1.3.2 标本DNA的提取20-21
• 1.3.3 PCR初筛标本21-22
• 1.3.4 菌株分离培养22
• 1.3.5 生化鉴定与生物分型22-23
• 1.3.6 提取目的菌株核酸23-24
• 1.3.7 16S rRNA基因T载体克隆24-27
• 1.3.8 序列分析27-28
• 2. 结果与分析28-39
• 2.1 目的菌株分离情况28-32
• 2.2 16S rRNA基因类型数32-33
• 2.3 不同种耶尔森菌菌株内16S rRNA基因相似性比较33-34
• 2.4 16S rRNA基因序列聚类分析34-37
• 2.5 不同种耶尔森菌16S rRNA优势基因类型37
• 2.6 不同种间耶尔森菌的16S rRNA共有基因序列分布37-39
• 3. 讨论39-46
• 参考文献46-52
• 附录一 综述52-63
• 参考文献59-63
• 附录二 研究生期间论文发表情况63-64
• 致谢64

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