河南地区耐碳青霉烯类药物铜绿假单胞菌耐药机制研究

发布时间：2017-09-16 07:15

  本文关键词：河南地区耐碳青霉烯类药物铜绿假单胞菌耐药机制研究

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【摘要】：背景与目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是医院内感染的主要条件致病菌之一,特别是在重症监护病房、呼吸科以及烧伤科。该菌正常情况下不会引起人类疾病,当人体免疫力低下、定植部位改变以及菌群失调时,导致人类感染。近些年来,由于抗生素的滥用情况日益严重,又因其固有的和获得性的耐药机制而使其对多种药物都能产生严重耐药,从而出现了多重耐药(multi-drug resistant,MDR)甚至泛耐药(pan-drug resistant,PDR)铜绿假单胞菌。碳青霉烯类抗生素是临床治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染的重要手段之一。但是,随着抗生素的滥用越来越严重,菌株对碳青霉烯类药物耐药现象越来越严重,耐药率呈逐年增高趋势,临床对于此类细菌所致感染几乎陷于束手无策、无药可用的困境。铜绿假单胞菌针对碳青霉烯类药物耐药主要有几个方面的原因,具体包括碳青霉烯酶的产生、主动外排泵过度表达、外膜通透性的改变、整合子介导耐药性改变等,其中,最为主要的是碳青霉烯酶的产生和外膜通透性的改变。碳青霉烯酶按Ambler分类分为三类,铜绿假单胞菌携带的主要是Ambler B类金属酶。而产生Ambler B类金属酶是目前该菌株对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。资料显示,国内外主要检测到六种Ambler B类金属酶,分别为IMP、VIM、SPM、SIM、GIM和NDM。铜绿假单胞菌携带的主要是IMP和VIM。早期发现的OXA酶属于窄谱性水解酶类,如0XA-1、0XA-2、OXA-10等。近年来,超广谱性OXA酶,甚至水解碳青霉稀类的OXA酶报道不断增多,但这些酶类除OXA-15和OXA-32超广谱酶外,其它的广谱OXA酶大多来自OXA-10的突变。外膜孔蛋白Opr D2(outer-membrane protein D2,Opr D2)的缺失也可导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药,并且通道蛋白的缺失往往伴随有外排泵系统系统的过度表达,这两者都在碳青霉烯类药物耐药产生过程中起着重要作用。整合子是细菌间的可移动遗传元件,其上多定位有多种耐药基因,且可在同种或异种细菌间传递,从而导致耐药性广泛传播。目前国内外发现的整合子主要有三类,分别为intⅠ、intⅡ、intⅢ,铜绿假单胞菌主要携带的为Ⅰ类整合子。依据国内外针对铜绿假单胞菌耐药性的研究现状,我们设计了本课题,旨在通过分析本地区耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药性表型,探究菌株所携带的碳青霉烯酶基因型种类、菌株通道蛋白表达状况以及菌株所携带整合子及其耐药基因盒种类,从而揭示本地区的铜绿假单胞菌耐药机制,为临床抗感染治疗提供实验室依据。方法1.菌株收集收集郑州大学第一附属医院2015年5月-2015年10月间的耐碳青霉烯类(亚胺培南或美罗培南)目的菌株86株,每株菌株均采用VITEKⅡ全自动细菌鉴定仪鉴定到种,并采用VITEKⅡ配套药敏卡片进行药敏试验,药敏结果判定参考CLSI2014版标准。采用-20℃保存菌株。2.耐药分析统计分析所收集菌株的科室分布、标本类型、各类常用抗生素耐药率,并以同时期收集的86株碳青霉烯类敏感铜绿作为对照组,比较两组菌株间耐药性差异。比较方法采用卡方检验。3.表型确证将菌株复苏后,挑取单个菌落制作0.5麦氏浊度菌悬液,均匀涂布M-H平板后,采用EDTA双纸片增效试验筛查产金属酶的铜绿假单胞菌。4.基因检测用特异性引物序列,采用聚合酶链式反应,检测A、B、D类碳青霉烯酶,Oprd2孔道蛋白以及整合子。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后,将阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果进行BLAST比对分析。结果1.科室、标本类型分布86株目的菌株主要来源于ICU 39个、介入科12个、神经外科12个,其它科室23个。从标本类型上看,主要是痰标本70、灌洗液4、分泌物4,其他标本包括2个胆汁、2个引流液、2个尿、2个脓液。2.耐药率分析耐碳青霉烯类药物PA对于临床常用抗菌药物的耐药率如下,阿米卡星40%、哌拉西林74%、头孢他啶53%、头孢吡肟47%、美罗培南89%、亚胺培南90%、氨曲南74%、环丙沙星51%、左氟沙星56%。由结果可知,菌株除了耐碳青霉烯类药物外,对于氨基糖苷类、广谱青霉素及喹诺酮类药物均有较高的耐药率。运用卡方检验分析与86株碳青霉烯类敏感菌对各类药物的差异性,每组药P均小于0.05,在α=0.05的检验水准下,认为耐碳青霉烯类PA和碳青霉烯类敏感PA对常见种类抗生素的耐药率有显著性差异。3.基因型检测86株铜绿假单胞菌中扩增出B类金属酶IMP11株、SIM2株、18株含有OXA-10,未检测到A类碳青霉烯酶GES。86株铜绿假单胞菌中,有54株菌株存在孔道蛋白缺失,仅32株扩增出通道蛋白,孔道蛋白缺失率达到63%。4.整合子检测86株目的菌中,26株扩增出Ⅰ类整合子,未扩增出Ⅱ、Ⅲ类整合子,4株扩增出1850bp长度的基因盒(dhfr XⅡ-orf F-aad A2),4株2000bp基因盒(aad B-aa C6-Ⅱ-PSE1),2株1270bp基因盒(aad A6-orf D),2株2000bp(imp26-qac G-aac A4),13株1000bp(aad A2),1株1600bp(aad A4-OXA142)结论:1.耐碳青霉烯类药物铜绿假单胞菌往往具有多重耐药性,临床应加强监测,严防此类菌株的扩散。2.河南地区分离PA对碳青霉烯类耐药的主要机制为携带碳青霉烯酶以及通道蛋白的缺失。3.河南地区分离PA主要携带的为I类整合子,整合子所携带耐药基因盒主要导致氨基糖苷类和碳青霉烯类耐药。
【关键词】：碳青霉烯类药物 铜绿假单胞菌 耐药机制
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 引言13-15
• 第一部分 耐碳青霉烯类药物铜绿假单胞菌耐药性分析15-21
• 1 材料与方法15-16
• 2 结果16-19
• 3 讨论19-21
• 第二部分 耐碳青霉烯类药物相关基因检测21-35
• 1 材料和方法21-25
• 2 结果25-33
• 3 讨论33-35
• 结论35-36
• 参考文献36-40
• 综述 铜绿假单胞菌耐药机制研究进展40-59
• 参考文献49-59
• 研究生期间研究成果59-60
• 致谢60

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本文编号：861623