新型聚阳离子脂质体包裹磷酸钙纳米粒复合载体用于基因传递的研究
发布时间：2017-09-21 13:51
本文关键词：新型聚阳离子脂质体包裹磷酸钙纳米粒复合载体用于基因传递的研究
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【摘要】：基因治疗为遗传性疾病、传染病和癌症等的治疗提供了良好的前景,而研制安全有效的基因传递系统将成为基因治疗研究的最重要方向之一。本文针对目前siRNA转染效率低,体内稳定性差等问题,结合阳离子脂质体和磷酸钙纳米粒的特点,构建内水相为磷酸钙-siRNA纳米粒,外层包裹聚阳离子脂质体的新型核-膜型复合载体,对其制备工艺进行了探讨,并研究了该载体的性质、细胞毒性、摄取、体外转染效率和体外基因沉默效率,最后考察该载体携载VEGF-siRNA在体内针对肿瘤微血管生成的抑制作用,以期为非病毒siRNA载体的设计提供新的思路和方法学基础。目的：通过分析siRNA传递过程中细胞内外的主要屏障并根据siRNA细胞内的作用机制和靶点,在传统磷酸钙载体的基础上构建具有阳离子聚合物和阳离子脂质特点、双重内体逃逸能力和肿瘤靶向的新型核-膜型siRNA复合载体,为非病毒siRNA载体的设计提供参考。方法：①聚乙烯亚胺-胆固醇的合成及表征。选用低分子量的聚乙烯亚胺(PEI),通过化学方式在其骨架上共价结合胆固醇,合成聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI 800-Chol),并考察了化合物的基本性质。②磷酸钙纳米粒的制备及表征。通过微乳法和共沉淀法制备磷酸钙纳米粒,考察纳米粒制备中的影响因素、纳米粒的基本性质,选择适合的制备途径,并利用琼脂糖凝胶电泳考察磷酸钙纳米粒携载siRNA能力,确定载体与siRNA的孵育比例。③聚阳离子脂质体／磷酸钙纳米粒复合载体(PLCP)的制备。通过脂质体包裹技术控制磷酸钙纳米粒的粒径,并对脂质体表面进行阳离子聚合物修饰,考察聚阳离子脂质体PCL和复合载体PLCP的形状、粒径及表面电位,测定复合载体PLCP的缓冲能力、细胞毒性,对PLCP的冻干保护剂进行了筛选,并对其体外转染能力做了初步评价。④复合载体细胞摄取评价。考察复合载体PLCP的细胞摄取能力,比较CaPNP、PCL、LipofectamineTM2000和PLCP四种不同载体在MCF-7细胞中的摄取能力,考察不同N/P对PLCP细胞摄取的影响,通过不同脂质构建复合载体,考察DOPE对复合载体细胞摄取的影响。⑤复合载体PLCP介导的siRNA体外基因沉默研究。一方面,通过设计针对GFP的siRNA干扰片段,以乳腺癌MCF-7细胞为细胞模型,选择PLCP进行转染效果验证,并检测经PLCP介导后anti-GFP siRNA对细胞模型内GFP mRNA表达的影响。另一方面,通过设计针对VEGF的siRNA干扰片段,以乳腺癌MCF-7细胞为细胞模型,通过实时荧光定量PCR法和Western blot测定经PLCP介导后anti-VEGF siRNA对肿瘤细胞内VEGF-mRNA和VEGF蛋白表达的抑制作用。⑥复合载体PLCP介导的siRNA抗肿瘤实验研究。建立MCF-7细胞裸鼠成瘤模型,研究复合载体PLCP介导的anti-VEGF siRNA在抑制肿瘤生长和抗肿瘤血管形成方面的作用。结果：①通过低分子量PEI(800Da)和胆固醇甲酰氯经反应合成PEI 800-Chol。经1H-NMR和红外光谱检测,胆固醇甲酰氯的酰氯基与PEI分子的胺基反应生成酰胺基,胆固醇共价结合到PEI分子骨架上,产物中没有包裹单体的胆固醇甲酰氯或其水解后的产物及羧基产物。②通过微乳法和共沉淀法制备磷酸钙纳米粒。微乳法制备中,选定Triton X-100/正已醇=3:2(w/w)、(Triton X-100+正已醇)/环已烷=6：4(w/w)为微乳液各组分之间的最佳比例,制得的CaP NP粒径为15.2±1.7nm,PDI为0.206±0.029,表面电位为-5.4±1.6mV。共沉淀法制备中,溶液的pH维持在6.95±0.65之间时,体系较为平稳,A、B两种溶液不同配比对纳米粒的粒径有明显影响,当B液：A液=1时,可以得到最佳粒径。制得的CaP NP粒径为148.9±21.8nm, PDI为0.248±0.017,表面电位为-13.6±1.0mV。通过比较两种制备方法,最终选定共沉淀法作为磷酸钙纳米粒的制备方法。琼脂糖凝胶电泳实验表明当CaP NP与siRNA质量比为15：1时,可以完全阻滞siRNA泳动。③在传统磷酸钙载体和脂质载体基础上,构建了内水相为磷酸钙/siRNA纳米粒,外层包裹聚阳离子脂质体的新型核-膜型复合载体PLCP。通过薄膜分散法制备聚阳离子脂质体PCL,制得的PCL/siRNA粒径为129.6±14.0nm, PDI为0.200±0.023,表面电位为39.3±6.2mV。复合载体PLCP的平均粒径为260.4±23.4 nm, PDI为0.188±0.038,表面电位为0.3±0.2mV,缓冲能力测定实验表明PLCP的缓冲能力介于PCL和PEI800之间,具有较强的缓冲能力。冻干保护剂筛选实验表明5%体系质量的甘露醇为最佳冻干保护剂。PLCP的细胞毒性明显小于PEI(分子量25kDa)/siRNA混合物,表现出较高的安全性,而其转染效率与PEI(分子量25kDa)/siRNA混合物相当。④通过比较CaP NP、PCL、LipofectamineTM 2000和PLCP四种不同载体在MCF-7细胞中的摄取能力,结果显示,PLCP介导的siRNA表现出最强的荧光强度。不同N/P对PLCP细胞摄取有显著影响,随着N/P的增加,荧光强度也增强,当N/P为20,荧光强度达到最大值,然后缓慢下降。通过构建PLCPs和PLCP两种复合载体,考察DOPE对复合载体细胞摄取的影响,结果表明PLCP介导的siRNA表达要明显优于PLCPs.⑤通过设计针对GFP的siRNA干扰片段,以稳筛GFP荧光蛋白的MCF-7为细胞模型,选择PLCP进行转染效果验证,结果显示GFP-443为最佳序列。体外基因沉默实验检测载体介导anti-GFP siRNA对细胞模型内GFPmRNA表达的影响,通过荧光图像和RT-qPCR法检测,结果显示CaP NP组未表现出明显基因沉默效应,PCL组可以有效地抑制GFP表达,但是,随着转染时间的增加,抑制效率反而下降,PLCP和LipofectamineTM 2000在整个转染时间(0-72h)可显著抑制GFP表达,在48h-72h,PLCP的沉默效率达到80%,明显高于LipofectamineTM 2000 (-60%)。通过设计针对VEGF的siRNA干扰片段,以乳腺癌MCF-7细胞为细胞模型,通过RT-qPCR法和Western blot测定经PLCP介导后anti-VEGF siRNA对肿瘤细胞内VEGF mRNA和VEGF蛋白表达的抑制作用。RT-qPCR结果表明,PLCP/VEGF siRNA2组表现出最优的沉默效率,VEGF siRNA则比随机序列的siRNA基因沉默效率更为显著。通过比较3个序列的VEGF siRNA以及与LipofectamineTM 2000组间的对比,VEGF-1137序列的siRNA可以获得非常低的VEGF表达。Western blot结果显示,经设计筛选的VEGF siRNA比随机序列的siRNA抑制蛋白表达作用更强。72h总体分析可见,PLCP/VEGF siRNA组抑制VEGF-A表达作用持续而稳定,与LipofectamineTM 2000/VEGF siRNA组对比,具有一定优势。⑥通过建立MCF-7细胞裸鼠成瘤模型,研究了复合载体PLCP介导的siRNA-VEGF在抑制肿瘤生长和抗肿瘤血管形成方面的作用。裸鼠皮下注射MCF-7细胞悬液,在第10天顺利成瘤,待肿瘤长至50-100mm3,随机分七组可进行后续实验。抑制肿瘤生长及抗肿瘤血管形成的效果判断：肿瘤生长体积方面,注射PLCP/siRNA-VEGF联合阿霉素组肿瘤体积明显减少；肿瘤微血管密度方面,注射PLCP/siRNA-VEGF联合阿霉素组和单纯注射PLCP/siRNA-VEGF组与各对照组相比的微血管密度明显降低；相关蛋白免疫组化测定方面,注射PLCP/siRNA-VEGF联合阿霉素组和单纯注射PLCP/siRNA-VEGF组的VEGF、 AKT2和HIF-1α的蛋白表达量与各对照组相比明显减少。结论：本研究构建了一种新型的用于RNAi基因沉默的PLCP传递系统。通过共沉淀法制备磷酸钙纳米粒,外层包裹聚阳离子脂质体PCL形成PLCP复合载体。载基因PLCP具有内体逃逸能力、低细胞毒性、高效的基因沉默效率和体内抑瘤能力,为有效传递治疗用siRNA提供了潜在的应用前景。
【关键词】：磷酸钙纳米粒 聚阳离子脂质体 siRNA 转染效率 血管内皮生长因子 基因沉默 抑瘤作用
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450
【目录】：
- 致谢4-5
- 摘要5-9
- ABSTRACT9-17
- 缩写、符号、术语表17-24
- 引言24-27
- 第一章 聚乙烯亚胺-胆固醇的合成及表征27-31
- 1 材料与仪器27
- 1.1 材料和试剂27
- 1.2 仪器27
- 2 实验方法27-28
- 2.1 聚乙烯亚胺—胆固醇的合成27-28
- 2.2 核磁共振波谱(~1H-NMR)检测28
- 2.3 红外光谱检测28
- 3 结果与讨论28-30
- 3.1 ~1H-NMR检测结果28-29
- 3.2 红外光谱检测结果29-30
- 4 小结30-31
- 第二章 磷酸钙纳米粒的制备及表征31-41
- 1 材料与仪器31
- 1.1 材料和试剂31
- 1.2 仪器31
- 2 实验方法31-33
- 2.1 微乳法制备磷酸钙纳米粒31-32
- 2.1.1 微乳液的制备及三元体系拟相图绘制31
- 2.1.2 微乳法制备磷酸钙纳米粒31-32
- 2.1.3 微乳法中去除有机相的后处理方法比较32
- 2.2 共沉淀法制备磷酸钙纳米粒32
- 2.2.1 共沉淀法制备磷酸钙纳米粒32
- 2.2.2 共沉淀法制备磷酸钙纳米粒的影响因素考察32
- 2.3 CaP NP的形态观察32-33
- 2.4 CaP NP的粒径及电位测定33
- 2.5 琼脂糖凝胶电泳33
- 3 结果与讨论33-39
- 3.1 三元体系拟相图33-34
- 3.2 共沉淀法制备磷酸钙纳米粒的影响因素考察34
- 3.3 CaP NP的形态观察34-35
- 3.4 CaP NP粒径及电位测定35-38
- 3.5 两种制备方法的比较38
- 3.6 琼脂糖凝胶电泳38-39
- 4 小结39-41
- 第三章 聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒复合载体的制备41-52
- 1 材料与仪器41-42
- 1.1 材料和试剂41
- 1.2 胞41
- 1.3 仪器41-42
- 2 实验方法42-43
- 2.1 聚阳离子脂质体(PCL)的制备42
- 2.2 聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒复合载体(PLCP)的制备42
- 2.3 PCL和PLCP的形态观察42
- 2.4 PCL/siRNA和PLCP的表征42
- 2.5 PLCP缓冲能力的测定42
- 2.6 PLCP的细胞毒性实验42-43
- 2.7 PLCP冻干保护剂的筛选43
- 2.8 PLCP的体外转染实验43
- 3 结果与讨论43-51
- 3.1 PCL和PLCP的形态观察43-45
- 3.2 PCL/siRNA和PLCP的表征45-46
- 3.3 PLCP缓冲能力的测定46-47
- 3.4 PLCP细胞毒性实验47-49
- 3.5 PLCP冻干保护剂筛选49-50
- 3.6 PLCP体外转染实验50-51
- 4 小结51-52
- 第四章 复合载体细胞摄取评价52-58
- 1 材料与仪器52
- 1.1 材料和试剂52
- 1.2 细胞52
- 1.3 仪器52
- 2 实验方法52-53
- 2.1 不同载体的细胞摄取研究52-53
- 2.2 不同N/P对PLCP细胞摄取的影响53
- 2.3 DOPE对PLCP细胞摄取的影响53
- 3 结果与讨论53-57
- 3.1 不同载体的细胞摄取研究53-54
- 3.2 不同N/P对PLCP细胞摄取的影响54-56
- 3.3 DOPE对PLCP细胞摄取的影响56-57
- 4 小结57-58
- 第五章 复合载体介导的siRNA体外基因沉默研究58-78
- 1 复合载体介导的anti-GFP siRNA体外基因沉默研究58-69
- 1.1 材料与仪器58-59
- 1.1.1 材料和试剂58
- 1.1.2 细胞58
- 1.1.3 仪器58-59
- 1.2 实验方法59-60
- 1.2.1 anti-GFP siRNA序列筛选59
- 1.2.2 复合载体介导的anti-GFP siRNA体外基因沉默实验59-60
- 1.2.2.1 细胞转染59-60
- 1.2.2.2 总RNA的提取60
- 1.2.2.3 RT-qPCR分析60
- 1.3 结果与讨论60-68
- 1.3.1 anti-GFP siRNA序列筛选60-66
- 1.3.2 复合载体介导的anti-GFP siRNA体外基因沉默实验66-68
- 1.4 小结68-69
- 2 复合载体介导的VEGF siRNA体外基因沉默研究69-78
- 2.1 材料与仪器69-70
- 2.1.1 材料和试剂69
- 2.1.2 细胞69
- 2.1.3 仪器69-70
- 2.2 实验方法70-71
- 2.2.1 细胞转染70
- 2.2.2 总RNA的提取70
- 2.2.3 RT-qPCR分析70-71
- 2.2.4 WB测定VEGF蛋白表达71
- 2.3 结果与讨论71-76
- 2.3.1 RT-qPCR法测定VEGF mRNA表达71-73
- 2.3.2 Western blot测定VEGF蛋白表达73-76
- 2.4 小结76-78
- 第六章 复合载体介导的siRNA抗肿瘤实验研究78-91
- 1 材料与仪器78-79
- 1.1 材料与试剂78
- 1.2 细胞78
- 1.3 动物78
- 1.4 仪器78-79
- 2 实验方法79-81
- 2.1 主要试剂配制79
- 2.2 裸鼠成瘤79
- 2.3 实验分组及给药79-80
- 2.4 皮下肿瘤体积及生长抑制率观察80
- 2.5 免疫组织化学80-81
- 2.6 微血管密度(MVD)测定81
- 3 结果与讨论81-89
- 3.1 PLCP介导的siRNA对肿瘤生长的作用81-84
- 3.2 PLCP介导的siRNA对肿瘤血管形成的作用84-89
- 4 小结89-91
- 全文总结91-93
- 参考文献93-98
- 综述98-112
- 参考文献106-112
- 作者简历及在读期间所取得的科研成果112
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本文编号：894904
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