基于开环反应构建多糖基多功能基因载体

发布时间：2017-09-22 14:52

  本文关键词：基于开环反应构建多糖基多功能基因载体

  更多相关文章： 基因载体 开环反应 普鲁兰 MRI 氨基糖苷类抗生素 抗菌

【摘要】：基因治疗可以治疗先天性遗传和后天性基因异常引起的疾病,受到各国科研工作者的关注。基因治疗的关键之一是构建安全、高效的基因载体。相比于病毒基因载体,阳离子基因载体具有转染效率高,无免疫原性,结构易于控制,可大规模制备等优点。随着临床上对基因载体提出MRI/CT成像,荧光成像,抗菌,载药,光热治疗等多元化的需求,构建多功能基因载体具有重要意义。普鲁兰(pullulan)是由出芽短梗霉产生的微生物多糖,具有生物相容性好,肝细胞靶向等优点；庆大霉素、妥布霉素和新霉素是由放线菌产生的氨基糖苷类抗生素,具有良好的生物相容性和抗菌性能。基于上述优越性,分别以普鲁兰、氨基糖苷类抗生素作为骨架,利用开环反应构建低毒、高效的多功能基因载体,本文的研究内容如下：1、首先,在pullulan上接上原子转移自由基聚合(ATRP)引发位点,得到引发剂Pullulan-Br。然后,通过ATRP法引发甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)得到PuPGMA,进一步用乙醇胺开环反应环氧基团得到阳离子聚合物PuPGEA。最后,通过邻二羟基与硼酸基团的成醚反应,静电相互作用,PuPGEA分别与小分子造影剂GdL, GdW自组装形成纳米颗粒PuPGEA-GdW, PuPGEA-GdL,构建了具有核磁造影功能的肝细胞靶向基因载体。对该载体系统进行了细胞活性,体外／体内基因转染效率,细胞吞噬和体外/体内MRI造影性能等评价,实验结果表明：基于普鲁兰的阳离子纳米颗粒PuPGEA-GdW和PuPGEA-GdL的细胞毒性小于“金标”PEI(25 kDa),在肝细胞中的基因转染效率更高。PuPGEA-GdW表现出的MRI造影性能更好。基于pullulan构建的具有肝细胞靶向和MRI造影功能的多糖基因载体的设计为多功能基因载体的构建提供了新的思路。2、用庆大霉素、妥布霉素和新霉素分别与羟乙基二硫双缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚开环反应,乙二胺(ED)封端来增加聚合物水溶性,制备得到可降解/不可降解的超支化聚合物SS-HP和HP。随后比较了超支化聚合物SS-HP和HP的细胞毒性,基因转染效率,细胞吞噬,红细胞溶血,抗菌性能。最后,建立C6脑胶质瘤动物实验模型,评价SS-HP和HP负载p53后的抑瘤性能。实验结果表明：由于双硫键可以被谷胱甘肽(GSH)生物剪切,SS-HP的基因转染效率显著高于HP,细胞毒性低于HP; SS-HP和HP均具有良好的生物相容性和抗菌性能；用新霉素构建的超支化聚合物SS-HPN和HPN的基因转染效率最高；SS-HPN和HPN负载p53抑瘤基因后具有良好的动物体内抗肿瘤效果。
【关键词】：基因载体 开环反应 普鲁兰 MRI 氨基糖苷类抗生素 抗菌
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-15
• 符号说明15-16
• 第一章 绪论16-28
• 1.1 基因治疗简介16-17
• 1.2 病毒基因载体17
• 1.3 非病毒基因载体17-22
• 1.3.1 阳离子载体17-19
• 1.3.2 阳离子脂质体19-20
• 1.3.3 天然多糖衍生物20-22
• 1.4 多功能阳离子基因载体的研究22-24
• 1.4.1 磁共振成像22-23
• 1.4.2 抗菌23-24
• 1.4.3 载药24
• 1.5 原子转移自由基聚合24-25
• 1.6 课题的设计意义25-28
• 1.6.1 基于开环反应构建具有核磁造影功能的多糖基因载体25-26
• 1.6.2 基于开环反应构建具有抗菌功能的超支化基因载体26-28
• 第二章 基于开环反应构建具有核磁造影功能的多糖基因载体28-46
• 2.1 引言28-29
• 2.2 实验部分29-34
• 2.2.1 实验材料与仪器29-30
• 2.2.2 阳离子聚合物PuPGEA的制备30-31
• 2.2.3 PuPGEA-GdL和PuPGEA-GdW纳米颗粒的制备31-32
• 2.2.4 聚合物表征32
• 2.2.5 聚合物/pDNA复合物的制备32
• 2.2.6 细胞活性评价32-33
• 2.2.7 基因转染效率测试33
• 2.2.8 细胞吞噬测试33
• 2.2.9 体外MRI测试33-34
• 2.2.10 体内实验34
• 2.3 结果与讨论34-45
• 2.3.1 PuPGEA-GdL和PuPGEA-GdW的合成34-37
• 2.3.2 阳离子聚合物的DNA缩合性能测试37-39
• 2.3.3 细胞活性评价39-40
• 2.3.4 体外转染效率测试40-41
• 2.3.5 细胞内吞测试41-43
• 2.3.6 体外MRI测试43-44
• 2.3.7 体内转染效率和MRI测试44-45
• 2.4 本章小结45-46
• 第三章 基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体46-64
• 3.1 引言46-47
• 3.2 实验部分47-53
• 3.2.1 实验材料与仪器47-48
• 3.2.2 基于抗生素构建超支化聚合物48-50
• 3.2.3 聚合物/pDNA复合物的制备50
• 3.2.4 表征实验50-51
• 3.2.5 细胞活性51
• 3.2.6 基因转染效率51
• 3.2.7 细胞吞噬51-52
• 3.2.8 抗菌性能52
• 3.2.9 体外溶血实验52-53
• 3.2.10 体内抗肿瘤评价53
• 3.3 结果与讨论53-62
• 3.3.1 超支化聚合物的DNA缩合性能测试53-55
• 3.3.2 细胞活性和基因转染效率测试55-57
• 3.3.3 细胞吞噬57-58
• 3.3.4 抗菌性能评价58-60
• 3.3.5 红细胞溶血试验60-61
• 3.3.6 体内抗肿瘤性能评价61-62
• 3.4 本章小结62-64
• 第四章 总结64-66
• 参考文献66-74
• 致谢74-76
• 研究成果及发表的学术论文76-78
• 作者简介78-80
• 导师简介80-82
• 附件82-83

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本文编号：901452