金黄色葡萄球菌的流式细胞术检测方法研究

发布时间：2017-09-25 05:31

  本文关键词：金黄色葡萄球菌的流式细胞术检测方法研究

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【摘要】：金黄色葡萄球菌是重要的食源性致病菌之一,由其引起的食源性疾病已引起了全世界的高度重视。金黄色葡萄球菌的快速检测是预防和控制细菌性食物中毒的有效手段。传统的检测方法需要进行细菌分离培养和一系列繁琐的生化实验鉴定,较为费时费力,不能满足快速检测的需求。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种集光学、电子学、免疫学等为一体的检测技术,可快速针对悬浮于液相环境中单个细菌或微球进行多参数定性和定量分析,现已广泛应用于细菌的常规工作和微生物学研究中。如:对微生物污染的水和食品样本进行细菌的快速计数、联合使用荧光染色的特异性配体鉴别目标细菌、通过制备配体功能化微球建立多重检测方法等。用于细菌检测的配体主要为抗体和适配体(aptamer)。适配体是一类利用SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技术筛选获得的核酸小分子,其作用原理与抗体相似,但相比抗体具有许多优势:化学稳定性强、筛选获得周期短、易于修饰、便于结合其他检测方法构建生物传感器等。但是高亲和力的、可直接用于实际应用的适配体很难筛选获得。因此,构建生物检测传感器时,应谨慎选择抗体或适配体作为配体,必要时也可两者联和使用。本课题旨在利用流式细胞术,建立基于配体识别的金黄色葡萄球菌检测方法,并对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的同时检测进行了探索性试验。运用流式细胞术分别建立了基于适配体识别的金黄色葡萄球菌检测方法和基于配体识别的金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法。具体研究内容如下:(1)基于适配体识别的金黄色葡萄球菌流式细胞术检测方法研究以金黄色葡萄球菌为研究对象,使用FAM荧光素标记的金黄色葡萄球菌特异性适配体SA17识别细菌,流式细胞术分析有荧光适配体结合的阳性细菌百分比。通过优化适配体折叠方式、适配体检测浓度,建立基于适配体识别的检测方法,并对建立的方法进行灵敏度验证。最后使用两种不同荧光素标记的配体同时对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的检测进行了探索性试验。为方便圈选细菌群体进行下一步分析,调节流式细胞仪FSC/SSC电压为对数模式。FAM荧光素标记的适配体SA17与金黄色葡萄球菌孵育结合,比较常见的4种核酸折叠方式对适配体检测效果的影响。分析显示单因素方差分析具有方差齐次性,4种折叠方式的适配体检测效果有显著性差异。LSD法两两比较显示未经高温变性折叠的适配体与其他3种折叠方式的检测效果相比差异极显著。以此折叠方式为基础优化适配体使用量,确定最佳工作浓度为250 nM。特异性分析显示,FAM-SA17与大肠杆菌O157:H7无交叉结合。金黄色葡萄球菌培养至108 CFU以上后,运用FCM 40 min完成检测,结果可靠。使用藻红蛋白-链霉亲和素-生物素标记的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体和FAM荧光素标记的SA17对两种细菌的混悬液进行检测,流式细胞术分析显示,由于大肠杆菌O157:H7单抗与金黄色葡萄球菌有非特异性结合,导致两种配体不能实现对两种菌的检测。绿色荧光区域的阳性百分比与使用FAM-SA17单一检测金黄色葡萄球菌时相比虽减小,但均为阳性结果。表明FAM-SA17可于两种菌的混悬液中特异性识别金黄色葡萄球菌。(2)基于配体识别的金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法研究制备金黄色葡萄球菌多克隆抗体和适配体功能化的磁性微球,磁性分离、富集细菌,分别以金黄色葡萄球菌适配体和多克隆抗体作为检测配体,运用FCM分析检测配体的荧光信号,比较4种模式的液相芯片检测结果。以基于金黄色葡萄球菌多克隆抗体的双抗夹心液相芯片进行下一步研究,优化检测抗体工作浓度,对建立的方法进行特异性和灵敏度验证。通过4种不同捕获配体与检测配体夹心的模式,比较液相芯片检测结果,以试验组的MFI/空白组的MFI≥3判定为阳性结果。结果显示,仅当捕获配体与检测配体均为金黄色葡萄球菌多克隆抗体时,液相芯片检测结果符合阳性判定标准。首先制备金黄色葡萄球菌抗体功能化羧基微球PSA-65,以此作为捕获微球。然后通过对金黄色葡萄球菌多克隆抗体进行生物素标记,以此作为检测抗体并优化其使用量,最终确定工作浓度为12μg/m L。特异性和灵敏度验证结果显示,建立的方法与其他五种常见食源性致病菌(单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌)无交叉结合反应,检测限为106 CFU。参照上述方法建立大肠杆菌O157:H7的液相芯片检测技术(大肠杆菌O157:H7抗体功能化羧基微球MEC-26),特异性结果显示MEC-26与金黄色葡萄球菌无交叉反应,同时使用MEC-26与PSA-65对两种目标菌的混悬液进行检测(检测抗体为两种检测抗体的混合物),与检测单一目标细菌比较,PSA-65检测结果保持一致,不受MEC-26和大肠杆菌O157:H7检测抗体干扰。本研究运用流式细胞术建立了特异性配体识别的流式细胞术检测方法和利用捕获微球检测的液相芯片检测方法。使用特异性适配体FAM-SA17直接检测金黄色葡萄球菌,不需进行折叠,大大缩短了适配体的前处理过程,检测过程更加省时、便捷。液相芯片间接检测方法,通过制备抗体功能化磁性微球进行磁性分离、富集细菌后,运用FCM分析荧光报告分子,结果更加真实、可靠。以上研究为食源性致病菌的检测提供了新方法,并具有一定的应用前景。
【关键词】：流式细胞术 液相芯片 金黄色葡萄球菌 适配体 检测
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一章 前言10-17
• 1.1 食源性致病菌的危害10
• 1.2 常见的食源性致病菌检测方法10-16
• 1.3 课题研究内容和意义16-17
• 第二章 基于适配体识别的金黄色葡萄球菌流式细胞术检测方法研究17-26
• 2.1 材料与设备17-18
• 2.2 方法18-19
• 2.3 结果19-23
• 2.4 讨论23-24
• 2.5 小结24-26
• 第三章 基于配体识别的金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法研究26-40
• 3.1 材料与设备26-27
• 3.2 方法27-31
• 3.3 结果31-36
• 3.4 讨论36-39
• 3.5 小结39-40
• 结论40-41
• 参考文献41-44
• 个人简介44-45
• 致谢45

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本文编号：915638