糖胺聚糖在脓毒症中内皮糖萼保护作用的研究

发布时间：2017-09-28 07:23

  本文关键词：糖胺聚糖在脓毒症中内皮糖萼保护作用的研究

  更多相关文章： 脓毒症 糖萼 肝素 乙酰肝素酶 基质金属蛋白酶-9 舒洛地特

【摘要】：脓毒症又称全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),是重症监护室位居第一的致死病症。脓毒症发病原因多为严重创伤、烧伤、器官移植或大手术之后带来的细菌、真菌、支原体、病毒等病原微生物所引起的感染,进而发展成为系统性炎症反应、免疫失控和凝血功能障碍的复杂性综合病症。炎症反应、免疫失控和凝血功能障碍三者相互作用又可导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS),最终导致患者死亡。脓毒症发病有逐年上升趋势,全球每年大约新增一千九百万例脓毒症患者。脓毒症的死亡率超过四分之一。脓毒症发病率高且发病机制复杂,其发病迅速,病程进展快,目前无有效的治疗手段,脓毒症和脓毒性休克已成为重症医学面临的首要难题。脓毒症中内皮细胞糖萼的破坏是病理进程中的重要环节。血管内皮糖萼的结构被破坏之后,其功能缺失。首先,血管内皮糖萼的屏障功能削弱或丧失,隐藏在其中的多种信号分子和酶也同时丧失；其次,血管内皮糖萼对内皮细胞的保护作用遭到破坏,糖萼的机械应力转导功能被削弱。之后,一系列病理改变出现,包括血管通透性增加,水肿的发生,内皮细胞与白细胞的粘附,凝血系统和抗氧化系统的失衡与血管紧张度降低等。肝素(Heparin,HP)和低分子肝素在脓毒症的治疗中已有多年临床实践经验,主要是发挥抗凝作用。鉴于糖胺聚糖是内皮糖萼的主要成分,脓毒症时外源糖胺聚糖对脓毒症时损伤糖萼的保护作用尚无系统的研究。本课题拟考察肝素及其衍生物以及舒洛地特(Sulodexide, SLX)干预对脓毒症时糖萼破坏因素以及糖萼破坏情况的影响,以及对心脏、小肠和脑部糖萼损伤的保护作用,以阐明糖胺聚糖类药物在脓毒症中的治疗作用及其机制。主要研究内容包括：1.建立小鼠脓毒症生存率模型,考察HP及其衍生物(包括SST0001, M402, ROH),乙酰肝素,SLX对小鼠脓毒症28天生存率的影响。其中ROH, HP, SLX可显著提高脓毒症小鼠的生存率。选择这三者开展后续研究。2.建立小鼠脓毒症模型,用ELISA法检测HP、ROH和SLX干预对脓毒症小鼠血清HPA和MMP-9这两个糖萼破坏因素、HS和Syndecan-1这两种糖萼脱落标志物的含量及时相变化的影响。2.1脓毒症时小鼠血清HPA含量变化以及糖胺聚糖对此影响。在脓毒症时,小鼠HPA血清含量在造模后3-12h与对照组相比显著下降(P0.05),且3h-12h时间段内小鼠HPA血清含量持续下降(P0.05)。HP组在造模后3 h,9 h,12h显著低于脓毒症模型组(P0.05),造模后6h与脓毒症模型组差异不显著(P0.05)；ROH组在造模后3 h,6,h 12h点明显低于脓毒症模型组(P0.05),在造模后9h与脓毒症模型组差异不显著(P0.05)；SLX组在造模后3h,6h,9h,12h与脓毒症模型组差异不显著(P0.05)。这一反常结果经多次重复实验确认,原因有待阐明。脓毒症时小鼠血清MMP-9的含量在3小时显著上升(P0.05),6小时达峰值,继而回落,在造模后9h和12h与对照组无显著差异(P0.05)。在造模后3h,HP组和ROH组与模型组相比显著下降(P 0.05), SLX组无显著性差异(P0.05)；造模6h后,HP组、ROH组和SLX组与模型组相比显著下降(P0.05)。这表明肝素、ROH和SLX可以显著抑制脓毒症中MMP-9的表达。2.3脓毒症时小鼠血清HS含量变化以及糖胺聚糖对此影响。脓毒症时小鼠血清HS含量在造模3h-12h的时间段内与对照组相比显著上升(P0.05),说明糖萼损伤已经发生。HP、ROH和SLX组在造模后3h-12h时间段内小鼠血清HS含量与模型组相比,显著下降(P0.05),但仍旧高于正常组。HS是由HPA水解糖萼产生,虽然在造模后3-12小时,脓毒症小鼠血清HPA含量始终低于正常对照组,但从后续实验免疫组化的结果来看,脓毒症小鼠在心脏、小肠、脑组织水平表达比正常对照组明显上升,说明组织中的HPA可以起到破坏糖萼的作用,因此在血清中可以检测到糖萼脱落标志物HS的含量上升。2.4脓毒症时小鼠血清Syndecan-1含量变化以及糖胺聚糖对此影响。脓毒症时小鼠血清Syndecan-1含量在造模3h-12h的时间段内与对照组相比显著上升(P0.05),说明糖萼损伤已经发生,脓毒症小鼠血清Syndecan-1含量在造模后3-9h持续上升,9h达峰值,继而下降,12h仍高于正常对照组,(P0.05)。HP组在3h、6h与模型组相比无显著性差异(P0.05)；9h与模型组相比,显著下降(P0.05),12h无显著性差异(P0.05)。ROH组在3h明显高于模型组(P0.05),6h与模型组相比无显著性差异(P0.05),9h、12h与模型组相比无显著性差异(P0.05)。SLX组在3h、6h明显高于模型组(P0.05),在9h、12h与模型组相比无显著性差异(P0.05)3.糖胺聚糖对脓毒症小鼠心脏损伤的保护作用。HE染色结果显示,脓毒症模型小鼠室壁局部心外膜下心肌细胞坏死、钙化,HP、SLX、ROH干预之后,炎症状况减轻。透射电镜观察发现脓毒症小鼠心脏主动脉内皮细胞糖萼破坏明显；HP、SLX、ROH干预之后,心脏主动脉内皮细胞糖萼损伤有不同程度的减轻。三者对脓毒症小鼠心脏保护作用的顺序为：SLXHPROH。免疫组化结果表明,脓毒症小鼠心脏组织中HPA, MMP-9的表达与对照组相比表达明显增多,而HP、SLX、ROH对这两种酶蛋白在心脏组织中的表达有抑制作用。4.糖胺聚糖对脓毒症小鼠小肠损伤的保护作用。HE染色结果显示,脓毒症模型小鼠小肠大量肠绒毛脱落,粘膜固有层血管扩张、充血,局部大范围肠粘膜全层坏死,HP、SLX、ROH干预之后,上述炎症状况减轻。透射电镜观察发现脓毒症小鼠小肠血管内皮细胞糖萼破坏明显；HP、SLX、ROH干预之后,小肠血管内皮细胞糖萼损伤有不同程度的减轻。三者对脓毒症小鼠小肠保护作用的顺序为SLXROHHP。免疫组化结果表明,脓毒症小鼠小肠中HPA,MMP-9的表达与对照组相比表达明显增多,而HP、SLX、ROH对两种酶蛋白在小肠中的表达有抑制作用。5.糖胺聚糖对脓毒症小鼠大脑损伤的保护作用。HE染色结果显示,脓毒症模型小鼠大脑皮层区域与对照组相比无明显病理学改变,而海马区神经元肿胀,部分神经元坏死。HP、SLX、ROH干预之后,海马区炎症状况减轻。透射电镜观察发现脓毒症小鼠大脑皮层内皮细胞糖萼破坏明显；HP、SLX、ROH干预之后,大脑皮层内皮细胞糖萼损伤有不同程度的减轻。三者对脓毒症小鼠大脑海马区的保护效果优劣排序大致为：ROH ≈ SLXHP。免疫组化结果表明,脓毒症小鼠大脑皮层和海马区HPA, MMP-9的表达与对照组相比表达明显增多,而HP、SLX、ROH对两种酶蛋白在大脑组织中的表达有抑制作用。综上所述,本研究可以得出如下结论：HP、SLX、ROH可以在脓毒症时发挥糖萼保护作用,降低脓毒症的死亡率。本课题的创新之处在于采用透射电镜方法考察了脓毒症小鼠心脏、小肠和大脑的内皮糖萼微观结构,透射电镜观察标本固定时未对小鼠做主动脉灌注,避免了糖萼在灌注过程中的脱落。本课题工作有待在以下几个方面深入：脓毒症小鼠的血清HPA含量与正常组相比骤然下降,这一反常结果经过多次重复实验都是如此,对此需要进一步研究以阐明其原因。ROH在脓毒症小鼠28天生存率中表现出色,尤其是在造模后第二天生存率高达70%。但在后续对心脏、小肠和大脑保护作用的研究中,虽然ROH对内皮糖萼保护作用明显,却并没有始终保持最佳表现,这说明糖萼损伤虽是脓毒症重要但非唯一的病理机制,ROH能够显著提高生存率的原因需要进一步探讨。由于大脑损伤对生存率的影响很大,且糖萼对血脑屏障有重要意义,应针对糖胺聚糖改善脓毒症血脑屏障损伤情况继续深入研究。
【关键词】：脓毒症 糖萼 肝素 乙酰肝素酶 基质金属蛋白酶-9 舒洛地特
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要12-16
• Abstract16-21
• 符号说明21-22
• 第一章 前言22-31
• 1 脓毒症22-23
• 2 糖萼23-24
• 3 脓毒症与糖萼24-26
• 4 脓毒症内皮糖萼损伤机制26-28
• 4.1 内皮糖萼与乙酰肝素酶26-27
• 4.2 内皮糖萼与基质金属蛋白酶.927-28
• 5 糖胺聚糖对脓毒症的治疗概况以及研究进展28-29
• 6 本课题的主要研究思路29-31
• 第二章 糖胺聚糖对小鼠脓毒症28天生存率的影响31-35
• 1 材料31-32
• 1.1 实验动物31
• 1.2 试药31-32
• 2 方法32-33
• 2.1 小鼠脓毒症生存率实验32
• 2.2 统计学处理32-33
• 3 结果33
• 4 讨论33-35
• 第三章 糖胺聚糖对脓毒症小鼠血清HPA和MMP-9、HS和Syndecan-1的含量及其时相变化的影响35-46
• 1 材料35-37
• 1.1 实验动物35
• 1.2 试药35-36
• 1.3 仪器36-37
• 2 方法37-39
• 2.1 脓毒症小鼠模型的建立、干预及血样采集37
• 2.2 血清HPA、MMP-9含量测定37-39
• 2.2.1 准备试剂与血清稀释37-38
• 2.2.2 检测程序38
• 2.2.3 脓毒症小鼠血清HPA、MMP-9含量计算38-39
• 2.3 脓毒症小鼠血清HS、Syndecan-1含量测定39
• 2.3.1 准备试剂与血清稀释39
• 2.3.2 检测程序39
• 2.3.3 脓毒症小鼠血清HS、Syndecan-1含量计算39
• 2.4 统计学处理39
• 3 结果39-43
• 3.1 脓毒症小鼠血清HPA、MMP-9含量40-42
• 3.2 脓毒症小鼠血清HS、Syndecan-1含量42-43
• 4 讨论43-46
• 第四章 糖胺聚糖对脓毒症小鼠心脏损伤的保护作用研究46-55
• 1 材料46-47
• 1.1 实验动物46
• 1.2 试药46-47
• 1.3 主要仪器47
• 2 方法47-50
• 2.1 脓毒症小鼠模型的建立47-48
• 2.2 HE染色方法考察心脏损伤情况48-49
• 2.3 透射电镜观察心脏糖萼结构49
• 2.4 免疫组织化学方法考察心脏HPA和MMP-9的表达49-50
• 3 结果50-53
• 3.1 HE染色考察心脏损伤情况50
• 3.2 透射电镜观察心脏内皮糖萼损伤情况50-52
• 3.3 免疫组织化学方法考察心脏HPA和MMP-9的表达52-53
• 4 讨论53-55
• 第五章 糖胺聚糖对脓毒症小鼠小肠损伤的保护作用研究55-62
• 1 材料55-56
• 1.1 实验动物55
• 1.2 试药55-56
• 1.3 主要仪器56
• 2 方法56-57
• 2.1 脓毒症小鼠模型的建立56-57
• 2.1.1 脓毒症小鼠模型的建立方法56
• 2.1.2 分组情况同第四章2.1.256
• 2.1.3 小肠标本的采集56-57
• 2.2 HE染色方法57
• 2.3 透射电镜观察方法57
• 2.4 免疫组织化学方法考察小肠HPA和MMP-9的表达57
• 3 结果57-61
• 3.1 HE染色考察小肠损伤情况57-58
• 3.2 透射电镜考察小肠内皮糖萼损伤58-60
• 3.3 免疫组织化学方法考察小肠HPA和MMP-9的表达60-61
• 4 讨论61-62
• 第六章 糖胺聚糖对脓毒症小鼠大脑损伤的保护作用研究62-72
• 1 材料62-64
• 1.1 实验动物62
• 1.2 试药62-63
• 1.3 主要仪器63-64
• 2 方法64-65
• 2.1 脓毒症小鼠模型的建立64
• 2.1.1 脓毒症小鼠模型的建立方法64
• 2.1.2 分组情况64
• 2.1.3 大脑标本的采集64
• 2.2 HE染色方法考察大脑损伤情况64
• 2.3 透射电镜观察大脑内皮糖萼损伤64-65
• 2.4 免疫组织化学方法考察大脑HPA和MMP-9的表达65
• 3 结果65-70
• 3.1 HE染色考察大脑损伤情况65-66
• 3.2 透射电镜观察大脑内皮糖萼损伤情况66-68
• 3.3 免疫组织化学方法考察大脑MMP-9和HPA的表达68-70
• 3.3.1 MMP-968-69
• 3.3.2 HPA69-70
• 4 讨论70-72
• 总结与展望72-75
• 参考文献75-81
• 致谢81-82
• 学位论文评阅及答辩情况表82

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