二氧化硅包裹四氧化三铁纳米粒子标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外研究

发布时间：2017-09-29 15:37

  本文关键词：二氧化硅包裹四氧化三铁纳米粒子标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外研究

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【摘要】：研究背景:目前,由于再生医学与组织工程学的发展与进步,干细胞技术也随之逐步走向成熟,应用干细胞移植治疗疾病已开始应用于临床。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),因其具有易于分离培养,免疫原性低,不涉及社会伦理问题,促进细胞植入和归巢的特性等优势,已成为国内外研究的热点。大量研究证明,无论是自体还是异体来源的BMSCs移植,在动物实验以及临床试验中均未见严重不良反应,无移植相关肿瘤形成,也未出现与移植相关的死亡案例,安全性较高。由于细胞在活体内不能长期示踪和动态监测,无法及时准确地掌握细胞在体内的分布、迁移、转化和归宿等信息,成为了阻碍BMSCs移植发展进步的一大难题。近年来,大量研究者使用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)来标记BMSCs,并通过核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),根据靶组织器官的磁共振信号改变来反映移植细胞在体内的情况,取得了良好的示踪效果。二氧化硅(silicon dioxide,Si O2)包裹四氧化三铁(ferroferric oxide,Fe3O4)纳米粒子是以Fe3O4纳米粒子为核心,具有超顺磁性,可作为MRI的阴性对比剂使用。而且,包裹在纳米粒子表面的二氧化硅层不但可以增加Fe3O4纳米粒子的粒径和分散性,提高组织兼容性,降低Fe3O4纳米粒子的毒副作用,还可以防止Fe3O4纳米粒子被分解为铁离子而失去超顺磁性,达到长期标记细胞的效果。此外,通过控制二氧化硅包裹纳米粒子的合成条件,可以制备出能够携带药物或其他小分子物质的磁性介孔二氧化硅纳米粒子。因此,当使用携带有特定药物的磁性介孔二氧化硅纳米粒子标记BMSCs后,利用磁力靶向引导和BMSCs的归巢特性,不仅可以动态监测BMSCs在体内的存活、分布、迁移、转化和归宿等生物学行为,还能起到靶向给药的作用,达到干细胞移植与靶向药物治疗双管齐下的目的。研究目的:本研究通过测量SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子对大鼠BMSCs的标记效率以及对大鼠bmscs细胞活力和细胞增殖的影响,探讨SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子标记大鼠bmscs的最佳方案。利用mri体外成像研究SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子标记bmscs后示踪的可行性,并初步确定体内实验的最佳细胞摄入量。为进一步探索bmscs移植后体内示踪,以及今后的临床应用bmscs移植治疗疾病提供可靠的实验依据。研究方法:1.利用全骨髓贴壁法提取原代大鼠bmscs,经过多次传代培养不断纯化,最终获得足够数量的细胞。2.通过观察大鼠bmscs的细胞形态和生长特性,检测细胞表面抗原的表达,以及体外多向诱导分化实验,对获得的细胞进行鉴定。3.化学共沉淀法合成Fe_3O_4纳米粒子,采用stober法在Fe_3O_4纳米粒子表面包裹SiO_2层,制备出SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子,并在透射电镜下观察其形态特征。4.配制不同铁浓度(0、25、50、100、200μg/ml)的SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子标记培养液,与大鼠bmscs孵育24h后,普鲁士蓝染色观察不同组SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子进入细胞的情况,并测定不同标记浓度下的阳性细胞标记率。5.各组SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子标记培养液与大鼠bmscs孵育后,在不同时间点对标记细胞进行台盼蓝拒染实验检测细胞活性。6.利用cck-8试剂盒检测不同浓度SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子对大鼠bmscs的细胞毒性以及对细胞增殖活性的影响。7.根据以上结果总结出SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子标记大鼠bmscs的最佳方案。选取最佳浓度和时间体外标记大鼠bmscs后,观察mri成像效果。研究结果:1.利用全骨髓贴壁培养法分离提取的大鼠bmscs,经过多次换液和传代,可以对其纯化,并在第3代时,获得了形态一致的大鼠bmscs。2.经传代培养后,细胞在形态和生长特性方面符合大鼠bmscs特征;流式细胞仪检测结果显示高表达mscs表面标志物cd44、cd90,而低表达cd34、cd45;成脂及成骨诱导分化实验表明该细胞可以向脂肪细胞和骨细胞分化。证明提取和传代培养的细胞为大鼠bmscs。3.制备出的SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子以球形为主,核心为单个或多个Fe_3O_4纳米粒子,外部为Si O2层,粒径大小为50~100 nm,具有超顺磁性和良好的分散性。4.普鲁士蓝染色显示SiO2@Fe3O4纳米粒子可被细胞摄取,集中在核周和细胞膜边缘,随着标记液铁浓度的增高,胞质内蓝染颗粒颜色加深;标记率与标记浓度正相关,各组标记率均达到95%以上,并且与25μg/ml组相比,50、100和200μg/ml组的标记率差异均具有统计学意义。5.台盼蓝拒染实验结果显示SiO2@Fe3O4纳米粒子与大鼠BMSCs孵育24 h后,200μg/ml组细胞出现了活性降低,具有统计学差异,而其他各组细胞活性均无明显影响;CCK-8毒性实验结果表明孵育24 h后,高浓度组(100、200μg/ml)SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子对大鼠BMSCs具有毒性。6.用50μg/ml铁浓度的SiO2@Fe3O4纳米粒子标记大鼠BMSCs 24 h后,1.5T MRI扫描成像结果显示,当标记细胞浓度为2.5×105个/ml时,在T2序列出现明显的信号降低,并且细胞浓度越高,信号降低越明显。结论:1.通过化学共沉淀法和Stober法可以制备出大小均一,粒径适中,具有超顺磁性和良好分散性的SiO2@Fe3O4纳米粒子。2.SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子可以成功标记大鼠BMSCs,并且在一定的安全浓度(25~50 ug/ml)下对大鼠BMSCs无毒副作用。3.大鼠BMSCs经SiO2@Fe3O4纳米粒子标记后,可在MRI中T2序列清晰地观察到低信号显像,为下一步大鼠BMSCs移植体内示踪奠定实验基础。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 四氧化三铁纳米粒子 二氧化硅 标记
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 绪论16-18
• 第1章 文献综述18-25
• 1.1 干细胞移植18-19
• 1.1.1 干细胞分类18
• 1.1.2 干细胞临床应用18
• 1.1.3 骨髓间充质干细胞移植18-19
• 1.2 干细胞体内示踪19-21
• 1.2.1 外源性标记基因转染19
• 1.2.2 荧光染料标记19-20
• 1.2.3 同位素标记20
• 1.2.4 超顺磁性氧化铁标记20-21
• 1.3 四氧化三铁纳米粒子21-22
• 1.3.1 Fe_3O_4粒子的性质21
• 1.3.2 Fe_3O_4纳米粒子的制备21
• 1.3.3 Fe_3O_4纳米粒子的表面修饰21-22
• 1.4 磁性介孔二氧化硅纳米粒子22-23
• 1.4.1 介孔氧化硅纳米粒子简介22
• 1.4.2 磁性介孔二氧化硅纳米粒子的合成22-23
• 1.4.3 磁性介孔二氧化硅纳米粒子应用于干细胞移植的优势23
• 1.5 小结23-25
• 第2章 大鼠BMSCS的分离培养和鉴定25-34
• 前言25
• 2.1 实验材料25-28
• 2.1.1 实验动物25
• 2.1.2 主要实验仪器25-26
• 2.1.3 主要实验试剂26-27
• 2.1.4 试剂配制27-28
• 2.2 实验方法28-30
• 2.2.1 原代BMSCs的分离和培养28
• 2.2.2 BMSCs的扩增和冻存28-29
• 2.2.3 BMSCs表面标志鉴定29
• 2.2.4 BMSCs的成脂诱导分化29
• 2.2.5 BMSCs的成骨诱导分化29-30
• 2.3 实验结果30-32
• 2.3.1 BMSCs形态学特征30-31
• 2.3.2 BMSCs表面标志物的表达31-32
• 2.3.3 BMSCs 成脂及成骨诱导分化潜能32
• 2.4 讨论32-33
• 2.5 小结33-34
• 第3章 二氧化硅包裹四氧化三铁纳米粒子的制备及其标记大鼠BMSCS的体外研究34-45
• 前言34
• 3.1 实验材料34-37
• 3.1.1 主要实验仪器34-35
• 3.1.2 主要实验试剂35-36
• 3.1.3 试剂配制36-37
• 3.2 实验方法37-39
• 3.2.1 SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子的制备37
• 3.2.2 普鲁士蓝染色检测细胞标记率37-38
• 3.2.3 台盼蓝拒染实验检测标记细胞活性38
• 3.2.4 CCK-8 检测细胞增殖活性38
• 3.2.5 标记细胞 1.5T MRI扫描成像38
• 3.2.6 统计学分析38-39
• 3.3 实验结果39-43
• 3.3.1 SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子的性状39-40
• 3.3.2 SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子标记细胞的阳性率40-41
• 3.3.3 SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子孵育时间和标记浓度对细胞活力的影响41-42
• 3.3.4 SiO_2@Fe_3O_4纳米粒子的细胞毒性42-43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 小结44-45
• 第4章 结论45-46
• 参考文献46-53
• 作者简介及在学期间取得科研成果53-54
• 致谢54

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