锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因的克隆与功能研究

发布时间：2020-04-10 03:15

【摘要】：锈赤扁谷盗Cryptodestes ferrugineus(Stephens)是世界上发生最为普遍的储粮害虫,锈赤扁谷盗的成虫和幼虫主要以粮食的胚部为食,由于其繁殖能力强,容易在粮库里大量繁殖,对储粮安全产生严重的危害。由于磷化氢的长期使用,加上施药者在使用过程中的不规范操作,致使锈赤扁谷盗普遍产生了高抗性。普遍的抗药性和锈赤扁谷盗种群猖獗,已成为当前粮食储藏中最为严峻的问题。因此,研发新型的、对环境友好型的杀虫剂,已成当务之急。几丁质主要存在于真菌的胞壁、甲壳类动物的外壳和昆虫的体壁中,高等哺乳动物不含有几丁质,因此根据几丁质生物合成途径研发新型杀虫剂已经成为当今热点。本研究以锈赤扁谷盗为研究对象,利用RNAi技术和实时荧光定量PCR(qPCR)对几丁质生物合成途径中的关键酶-几丁质合成酶2(CHS2)基因的特性和功能进行了深入的研究,为以后利用几丁质合成酶来防治锈赤扁谷盗提供理论基础与科学依据。定虫隆作为一种几丁质合成抑制剂被广泛应用,而定虫隆对锈赤扁谷盗生长发育产生的影响,及可能的作用靶标尚没有系统性的研究。本研究以锈赤扁谷盗为对象,通过亚致死剂量的定虫隆处理锈赤扁谷盗,研究定虫隆对其生长发育的影响,及可能作用的靶标,为以后定虫隆用于储粮害虫的防治提供理论基础。具体内容如下:一、锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因的克隆根据转录组测序序列与其他昆虫的CHS2基因进行同源对比,找到保守区设计引物,扩增了锈赤扁谷盗CHS2基因的3个片段,利用DNAMAN软件拼接后获得了锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因完整的开放阅读框。将拼接得到的锈赤扁谷盗CHS2的基因序列翻译成氨基酸,与赤拟谷盗等昆虫的氨基酸进行同源对比,构建进化树,结果显示锈赤扁谷盗的CHS2与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)的CHS2蛋白亲缘关系较近,命名该基因为CfCSH2(GenBank登陆号MH234580)。采用NCBI中的ORF Finder软件分析表明,其开放阅读框ORF包含4428bp,编码1475个氨基酸。氨基酸序列没有信号肽,有11个预测的糖基化位点,包含了14个跨膜结构,说明其编码的蛋白是一个跨膜蛋白。其中的322(523-845)个氨基酸是几丁质合成酶的保守序列,含有几丁质合成酶特有的标签序列EDR和QRRRW。二、锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因的时空表达利用实时荧光定量PCR技术(qPCR)对锈赤扁谷盗不同发育阶段几丁质合成酶2(CfCHS2)基因的表达进行分析。结果表明,CfCSH2在锈赤扁谷盗卵、幼虫、蛹和成虫不同发育阶段均有表达,但表达量差异显著(P0.05)。幼虫阶段CfCSH2在1龄的相对表达量最多,随后逐渐减少,在蛹期表达量最低,卵期有少量表达,成虫期最多。说明了该基因在锈赤扁谷盗进食期表达量较多,非进食期表达量较少。CfCSH2在锈赤扁谷盗不同组织的表达量有显著差异(P0.05)。在成虫表皮中基本不表达,在头部、胸部、脂肪体中有少量的表达,腹部的表达量最高,其次是中肠,腹部的高表达量可能与其样品体积较大,包含组织较多有关。三、锈赤扁谷盗几丁质合成酶2基因的功能研究利用RNAi干扰技术研究了几丁质合成酶基因的功能及其对昆虫生长发育的影响。分别用体外注射和饲喂的方法在锈赤扁谷盗幼虫体内实现了CfCHS2基因的沉默。结果表明:无论使用注射还是饲喂的方法,RNA沉默后幼虫均出现躯体蜷缩,腹部干瘪,无法正常爬行的现象。同时发现注射dsRNA的最佳干扰效率能达到64.83%,显著高于饲喂组49.59%的干扰效率。持续饲喂7天后,实验组的死亡率达到63.33%,显著高于对照组的6.67%。在持续饲喂dsRNA的过程中发现CfCHS2出现过表达的现象,CfCHS2基因的表达量呈现出先下降后上升再下降的现象,这说明在CfCHS2被dsRNA沉默后,昆虫为了维持机体的稳定,提高了机体CfCHS2的表达量,从而形成一种代偿性增加的反馈机制。对RNAi处理后的锈赤扁谷盗的中肠进行了甲苯胺蓝染色和透射电镜的研究,结果发现经过沉默CfCHS2基因后的幼虫中肠围食膜缺失,肠道上皮细胞没有围食膜的保护,不能附着在中肠横肌,严重受损。这些结果说明几丁质合成酶2在锈赤扁谷盗中肠围食膜的形成过程中发挥重要的作用。CfCHS2基因的沉默会使锈赤扁谷盗发育受阻,导致死亡。实验选用纳米壳聚糖作为传递载体,通过饲喂法使目的基因的表达量显著下降,锈赤扁谷盗死亡率显著升高,为以后基于RNAi技术防治锈赤扁谷盗提供了科学依据。四、定虫隆对锈赤扁谷盗生长发育的影响及其作用机理研究建立了定虫隆对锈赤扁谷盗作用的毒力方程:y=7.514+1.81x,r=0.974,计算得LD50为0.041 mg/kg,95%置信区间为0.025~0.059mg/kg;亚致死剂量LD_(10)、LD_(20)、LD_(30)分别为0.008mg/kg、0.014mg/kg、0.021mg/kg。另外研究发现亚致死剂量定虫隆处理能够显著延长锈赤扁谷盗生长发育的历期,体重显著下降(P0.05)。经定虫隆LD_(30)长期处理的锈赤扁谷盗,体重可下降25%。低剂量的定虫隆就可以导致锈赤扁谷盗几丁质含量显著下降(P0.05),说明定虫隆对锈赤扁谷盗的生长发育具有显著的抑制作用,可以用于储粮害虫锈赤扁谷盗的防治。实验发现用LD_(30)定虫隆处理锈赤扁谷盗三龄幼虫CfCHS1基因的表达量明显上调,是对照组的1.787倍。CfCHS2基因的表达量也明显上调,是对照组的1.274倍。推测定虫隆的作用靶标是锈赤扁谷盗几丁质合成酶,其抑制了CHS酶活性,使CHS不能正常的进行几丁质的合成。
【图文】：

几丁质,分子结构式

虫几丁质概述质（chitin）又叫甲壳素，是自然中分布最广泛、储存量仅次于在昆虫体内，几丁质与蛋白质相互作用形成昆虫的表皮，，并且中肠围食膜重要的结构成分[24]，这些能使昆虫在生长发育的过素对昆虫的侵害[25]。昆虫的生长与变态发育都依赖了几丁质结质是由 N-乙酰基-D-葡糖胺通过β-1,4-糖普键连接而形成的高聚N)n，结构图见图 1。它存在 3 种不同的晶体形态:α-几丁质、β一种形态均具有不同的生物化学特征。α-几丁质刚性最强，在它主要存在于昆虫外骨骼中以及幼虫头壳中。β-几丁质和 γ-几于需要柔性的部位中，比如围食膜[26-29]。昆虫的蜕皮和生长发降解的调控[30]，因几丁质的化学结构和植物纤维素十分相似，

几丁质,生物合成途径,关键酶,昆虫

河南工业大学硕士学位论文死亡。目前关于苯甲酰基脲类杀虫剂的作用机理仍不清楚，苯甲酰基脲对幼虫有显的杀虫效果，但对高龄期和成虫期的害虫毒性较小，速效性较差。
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S379.5

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