锈赤扁谷盗对磷化氢产生抗性的机理研究

发布时间：2020-07-01 15:10

【摘要】：锈赤扁谷盗是世界经济储粮害虫,极易产生磷化氢抗性。然而,该物种分子信息的缺乏一直是人们探究此物种磷化氢抗性产生机制的瓶颈所在。因此,我们采用高通量测序技术对锈赤扁谷盗进行转录组和数字基因表达谱测序,以获取更多的锈赤扁谷盗基因信息资源,为其磷化氢抗性机理研究奠定分子基础。主要研究成果如下:1.本试验锈赤扁谷盗试虫有苏州张家港,四川成都和苏州太仓品系,其LC50值分别为0.079 mg/L、0.126 mg/L、19.904 mg/L。按照联合国给出的敏感品系LC50值比对可以得到各个品系的Rf值:ZJGCF的Rf值为7;CDCF的Rf值为12;TCCF的Rf值为1809。2.通过Illumina Hiseq2000平台测序,总计产出4,625,016,480的数据。组装结果得到总长度为51,214,942bp共47,006个Unigene,其中有28,491,14,036,23,667,21,320,12,576,14,930个unigene能够分别注释到Nr,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO数据库。预测编码蛋白框(CDS),比对到蛋白库的CDS有28,658个,预测出的CDS有5,973个,共34,631个。GO功能分类,共得到115,410个功能注释。3个ontology大类中,生物过程组最大,主要参与细胞加工和单细胞有机体加工。其次是细胞组分,以细胞、细胞的部分以及细胞器为主;分子功能组注释最少,基因数量较多的两个亚功能分类是结合能与催化活性。COG数据库将注释到的28,976条unigene分类成了25个分子家族。主要是与一般功能预测类、复制,重组和修复、转录等基本的生物过程有关的基因。Pathway显著性富集分析显示总共有21,320个unigenes参与到258条通路上。主要富集在代谢通路,其次是肌动蛋白细胞骨架的调节通路。并且通过归纳整理共鉴定出4,836个SSRs和120,212个SNPs,为种群遗传学研究提供有效工具。3.通过对锈赤扁谷盗磷化氢敏感品系与抗性品系的数字表达谱测序,分别获得了11.7到12.6百万之间的clean reads。差异表达基因37,792条,包括23,802条上调基因,13,990条下调基因。其中有28个上调和26个下调共54条显著性差异的基因(FD≤0.001且log2Ratio≥1)。GO功能分析显示共有54个显著富集的GO term。Pathway显著性富集分析显示共有36条显著富集的Pathway。通过表达模式聚类分析进一步将差异表达基因中功能类似的基因聚类,所有的这些包含的基因很可能与磷化氢抗性密切相关。对比锈赤扁谷盗磷化氢抗性品系和敏感品系的基因表达量,发现在上调基因中注释为表皮蛋白的基因占很大比例,研究表明其在毒性机制中通常参与调节表皮对杀虫药剂渗透性。下调基因中有明确功注释的是编码细胞色素b,ATP合成酶亚基及NADH脱氢酶亚基等蛋白质的基因。查阅文献可知上述下调基因都是线粒体中参与细胞呼吸关键基因。经磷化氢长期熏蒸后,参与编码此类基因的表达丰度显著下降,说明磷化氢抗性机制的形成与线粒体有着密不可分的关系,对其关键调控蛋白的研究有助于阐明磷化氢抗性机制。4.将锈赤扁谷盗转录组的Unigenes与NCBI上Drosophial melanogaster的一支抗逆性相关基因(解毒代谢酶)进行比对并进行进化树分析。一共筛选出103个与解毒代谢相关的Unigene。它们是三类主要的解毒代谢酶类,包括细胞色素P450(CYP P450,68条)、谷胱甘肽转移酶(GSTs,25条)和羧酸酯酶(Car Es,10条)。筛选出抗逆性相关基因并进行同源性分析明确其家族分类将为后续的功能研究提供基础数据,也有利于阐明锈赤扁谷盗磷化氢抗性产生机制。5.首次运用三种算法(ge Norm,Norm Finder和Best Keeper)筛选出一组适用于校准锈赤扁谷盗基因表达量的q RT-PCR实验的内参基因。结果显示γ-TUB+RPS13是分析不同发育阶段基因表达谱的最佳内参基因组合,SDHA+RPS13+GAPDH则是分析锈赤扁谷盗不同品系基因表达差异的最理想组合。
【学位授予单位】：南京财经大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S379.5
【图文】：

锈赤扁谷盗对磷化氢产生抗性的机理研究

熏蒸装置

转录组,实验流程,测序,转录本

图 3.1 转录组测序实验流程Figure 3.1 Process of transcriptome sequencing3.1.3.3 De novo 组装与功能注释将测序得到的 raw reads 过滤，去除那些含有接头，不确定碱基比例大于 5%和低质量的 reads，从而获得 clean reads。后续的 de nove 转录组分析则基于这些reads 使用 short-read 组装程序 Trinity 进行组装。首先具有一定重复序列的 reads将被拼接成更长的片段（contigs），将这些 reads 通过末端配对软件（paired-endreads）与 contigs 重新比对。此程序不仅能够检测到来自相同转录本的 contigs，也能够确定这些 contigs 之间的距离。最终，Trinity 将这些来自同一转录本的18

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