猪粪堆肥脱臭菌的筛选应用及其脱臭机理研究

发布时间：2020-07-10 13:50

【摘要】：随着畜牧养殖业的发展,我国畜禽粪便的年产量逐年上升,若不经适当处理会造成大量资源浪费,严重污染环境。猪粪在畜禽粪便中占有较大比重,目前,添加腐熟菌堆肥处理猪粪已得到广泛应用,然而在猪粪高温堆肥过程中氨气等臭气释放降低了堆肥氮素含量,还影响到了堆肥工业化生产。本研究筛选得到高效脱臭菌,优化其发酵工艺;将筛选得到的脱臭菌应用于猪粪堆肥中,探究其对猪粪堆肥氨气释放的抑制效果和保氮作用,并研究了脱臭菌脱臭保氮的机理。本研究以猪粪堆肥脱臭为目的,从土壤和猪粪堆肥中筛选出对氨气去除能力较强的常温脱臭菌1-6和耐高温脱臭菌S4。通过生理生化实验和16S rDNA序列分析,分别鉴定为Bacillus amyloliquefaciens 1-6 和 Bccillus lincheniformis S4。菌株1-6和S4对氨气去除率分别为52.74%和45.22%。对B.lincheniformis S4培养基组分和发酵条件进行优化,优化后的摇瓶发酵培养基配方为(g/L):葡萄糖15,酵母粉 10,KH2P041.5,MgS041,MnS040.005,CaC120.3。发酵条件:37℃,初始pH8.0,接种量2%,装液量30 mL/250 mL,发酵48h生物量达到1.48×1010CFU/mL,芽孢率 85%。以猪粪和玉米秸秆为原料进行堆肥实验,在自制堆肥装置中,对脱臭菌在猪粪堆肥中的脱臭效果进行测定。在单一脱臭菌堆肥实验中,耐高温脱臭菌的接种加快了堆体升温速度,使高温期延长了 3d;在高温期初始阶段,堆肥NH3释放量达到最大值,接种常温脱臭菌堆肥处理(T1)和接种耐高温脱臭菌堆肥处理(T2)的氨气释放量分别为437.67 mg/h和576.18 mg/h,远低于对照组(CK)氨气释放量967.53 mg/h,T1和T2组氨气释放总量相比CK组分别减少38.44%和52.15%,T1和T2组总氮含量的增长率是CK组的1.69倍和1.93倍,添加脱臭菌对猪粪堆肥起到了脱臭保氮的效果。在复合脱臭菌堆肥实验中,接种两种脱臭菌堆肥处理(T2)的氨气释放量为543.29 mg/h,远低于对照组(CK)氨气释放量766.45 mg/h和接种腐熟菌堆肥处理(T1)氨气释放量1148.64 mg/h,T2组堆肥处理氨气释放总量对比T1组处理减少64.52%,T2组总氮含量的增长率是CK和T1组的1.46倍和2.23倍,表明1-6和S4协同作用对猪粪堆肥的脱臭保氮能力高于单一脱臭菌作用。对猪粪堆肥脱臭菌的脱臭保氮机理进行研究,B.amnlyloquefaciens 1-6和B.lincheniformisS4对产臭、腐败微生物具有拮抗作用,能抑制这些微生物产生恶臭气体;脱臭菌具有产酸能力,1-6和S4能够产生甲酸、乙酸和丙酸,可降低堆体pH从而减少堆肥中氨气的释放,1-6和S4乙酸产量分别为379.20 mg/L和318.29 mg/L;通过对脱臭菌不同有机氨的利用能力分析,发现菌株1-6和S4对氨态氮利用能力较强,并能将氨转化为硝酸盐,其中1-6氨转化能力较强,对脱臭菌氨单加氧酶基因(amoA)的鉴定结果表明,脱臭菌B.amyloliquefaciens1-6是一种异养亚硝化细菌;脱臭菌的接种,增加了堆体中异养亚硝化细菌的数量,减少了氨气的释放。脱臭菌B.amvloliquefaciens1-6和B.lincheniformB.S4基于上述机理在猪粪堆肥过程中对NH3释放有明显抑制作用,有助于氮素固定于堆料中,减少氮素的损失。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S141.4
【图文】：

曲线,葡萄糖,曲线,法度

磷酸缓冲液至２．５０邋ｍＬ，在每只比色管中加入３．００邋ｍＬ邋ＤＮＳ试剂，沸水浴５邋ｍｉｎ，逡逑取出后立即用冷水冷却，蒸馏水定容至２５邋ｍＬ，在波长５４０邋ｎｍ处测其吸光度，逡逑绘制好的葡萄糖浓度与吸光度的标准曲线如图２．１所示：逡逑葡萄糖标准曲线逡逑０．９０逡逑0邋８0逦ｙ邋＝邋０＾４４１４ｘ邋－邋０．００８０８逡逑０：７０逦Ｒ！＝邋0＂７８７逡逑０．６０逡逑０．５０逡逑Ｉ邋０４０逡逑§邋０３０逡逑０．２０逡逑０．１０逡逑０．００邋逦逡逑－０．１邋（ｐ00邋０３０逦１．００逦１．５０逦２．００逦２．５０逦３．００逦３．５０逦４．００逡逑商萄耱法度（ｉｎｇ／ｍＬ〉逡逑图２．１葡萄糖的标准曲线逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｇｌｕ逡逑２１逡逑

生长情况,菌株,生物量,脱臭

（ＯＤ６00）在３７°Ｃ条件下发酵２４ｈ后都能达到１０以上；由于堆肥过程中存在一逡逑段持续时间较长的高温期，因此在堆肥实验中接种的外源微生物需要对高温环境逡逑具有一定的耐受能力，图３．２为３０°Ｃ至５０°Ｃ条件下，对脱臭菌和腐熟菌发酵２４ｈ逡逑的生物量测定结果。逡逑１＃?—■—邋Ｂ．ｔ？ｑｕｌｌｅｎｓｉｓ邋Ｂ４逦－邋Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ邋ＡＮＨ－２－５逡逑—？—Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｏｆａｃｉ？ｎｓ邋１－６邋￣－邋Ｂ．ｌｎｃｈｅｎｌｆｏｒｍｌｓ邋Ｓ４逡逑３Ｄ逦３５逦ＴＯ逦５０逦Ｓ５逡逑Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ＣＢｃ邋）逡逑图３．２温度对不同菌株的生长情况的影响逡逑Ｆｉｇ．３．１邋Ｔｈｅ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＾邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｔｏ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｔｒａｉｎｓ逡逑当培养温度在４５°Ｃ以上时，４株芽孢杆菌的生物量都开始下降，其中常温菌逡逑Ｂ４和１－６的生物量（ＯＤｗ）下降较为明显。当温度升高至５０°Ｃ时，常温菌Ｂ４逡逑和１－６的生物量降至１左右，生长受到强烈抑制，但仍然具有有一定的活性；而逡逑耐高温菌的生长活性任保持较高水平，ＡＮＨ－２－５的生物量（ＯＤ６0ｑ）为６．８９，Ｓ４逡逑的生物量（ＯＤ６00）达到９．５４。逡逑表３．４展示了邋５０°Ｃ至７０°Ｃ条件下，脱臭菌和腐熟菌在ＬＢ平板上的生长情况。逡逑在ＬＢ平板上划线培养４８ｈ后

芽胞,酵母粉,生物量

３．２．２．２氮源的选择逡逑测定不同有机氮源对生物量的影响，选择豆粕、脱脂大逡逑豆粉、酵母粉和玉米浆作为待选氮源。由图３．４可知，氮源浓度相同时，使用酵逡逑母粉Ｓ４的生物量最高。进一步考察了不同酵母粉浓度对菌株Ｓ４生物量的影响，逡逑酵母粉浓度为２０邋ｇ／Ｌ时，其生物量达到最高。逡逑２ｉＪａ逦ｂ逦｜逡逑Ｎ１：邋Ｓｏｙｂｅａｎ邋ｍｅａｌ逦Ｎ３：邋Ｙｅａｓｔ邋ｐｏｗｄｅｒ邋％，逡逑１８＇邋Ｎ２：Ｄｅｆａｔｔｅｄ邋ｓｏｙｂｅａｎ逦Ｎ４：邋Ｃｒｏｎ邋ｓｔｅｅｐ邋ｌｉｑｕｏｒ逦Ｖ／Ｗ／／逦ｙ７７／７ｍ逡逑＿＿逡逑［］逦ｔ］３逦Ａ逦］逦５逦１０逦１５逦２０逦２５逡逑Ｎｉｔｒｏｇｅｎ邋ｓｏｕｒｃｅ邋（１０邋ｇ／Ｌ）逦Ｙｅａｓｔ邋ｐｏｗｄｅｒ邋（ｇ／Ｌ）逡逑图３．４不同孰源对Ｓ４芽胞产量的影响逡逑Ｆｉｇ．邋３．４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｎｉｔｒｏｇｅｎ邋ｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｎ邋ｓｐｏｒｅ邋ｏｆ邋Ｂ．ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ邋Ｓ４逡逑３．２．２．３无机盐的选择逡逑本实验考察了不同浓度a愃岫#钾、硫酸镁以及硫酸猛对Ｓ４逡逑生物量的影响，如图３．５所示。逡逑｜｜｜＿逡逑１－０逦１５逦２０逦２５逦０．５逦１．０逦１．５逦２０逦２．５逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＫＨ２Ｐ0４邋（ｇ／Ｌ）逦Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭｇＳ0４邋｛ｇ！Ｄ逡逑３６逡逑

【参考文献】