纳米银对土壤氮素微生物转化过程的影响及其机制

发布时间：2020-07-25 11:53

【摘要】：纳米银(AgNPs)是应用最广泛的商品化纳米材料之一,近年来消费品中含有AgNPs的数量和比例增加,随AgNPs生产制造、使用及废弃的过程使其不可避免的进入陆生系统之中。AgNPs拥有良好的长效广谱抗菌作用,对多种微生物具有强烈抑制作用。土壤氮素转化过程主要由土壤微生物介导,当AgNPs进入土壤环境后对土壤微生物的活性造成损伤。AgNPs作为新型污染物质进入农田环境中,对土壤微生物、作物氮素利用均会造成一定程度的影响,其中由硝化细菌所介导的土壤硝化反应对AgNPs均有高度敏感性。研究调查AgNPs在土壤中的迁移转化、化学特性及毒理作用是监控及治理新型土壤污染物的必要手段,探讨AgNPs对土壤微生物的抑制机理以及对氮素转化微生物和相关功能基因表达量的影响,对治理和缓解释放到土壤环境中的AgNPs所产生的危害提出具体的指导方向。本研究在实验室培养条件下,采用批量处理实验方法探讨AgNPs暴露对土壤微生物多样性、土壤氮素转化关键微生物过程、AgNPs对土壤微生物抑制机理以及AgNPs对土壤氮初级转化速率的影响进行研究。通过实验室纯培养条件下基于Illumina测序平台研究了暴露在AgNPs环境中对土壤微生物多样性的影响;探究土壤AgNPs对土壤氨化、硝化作用强度的影响,并采用实时荧光定量(Real-timeQuantitative Polymerase Chain Reaction Detecting System,QPCR)扩增仪测定AgNPs对土壤氮素转化关键功能基因拷贝数的影响;研究AgNPs对土壤氮素转化关键微生物活性的抑制机理,采用氨氧化细菌模式菌株欧洲亚硝化毛杆菌Nitrosomonaseuropeae作为研究对照,比较不同剂量、尺寸及释放Ag~+对N.europeae活性的影响;基于~(15)N同位素稀释技术研究在AgNPs对土壤氮初级硝化速率、土壤氮初级矿化速率的影响,并测定AgNPs对土壤无机氮肥及有机氮肥转化、酶活性的影响。本文为AgNPs新型污染物所导致的土壤微生物群落结构的改变、土壤氮循环的影响及肥料利用提出量化分析结果的参考。本文主要研究结果如下:1.采用实验室纯培养的方式将土壤分别暴露在AgNPs含量为10、50、100 mg/kg的环境中28℃培养7 d,采用氯仿熏蒸及土壤诱导呼吸的方式测定AgNPs对土壤微生物生物量氮和活性的影响,并通过提取土壤细菌总DNA采用Illumina测序平台对V4区域进行土壤微生物群落多样性分析。研究结果表明,土壤暴露在AgNPs环境中抑制土壤微生物的活性,当AgNPs含量分别为10、50、100 mg/kg时,空白对照组土壤微生物生物量氮含量分别高于AgNPs处理组33.0%、58.7%、71.1%;空白对照组诱导呼吸量高于AgNPs处理组1.17%、17%、29.3%,即低剂量AgNPs暴露条件下对土壤诱导呼吸量抑制不显著。土壤微生物多样性研究结果分析表明,在属分类水平土壤AgNPs暴露剂量和所检测出细菌类群的种类呈现负相关,但优势门类检测数量基本一致。不同剂量AgNPs暴露下对土壤微生物主导菌群门类(变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、放线菌门Actinobacteria)不产生显著作用,变形菌门群落丰度百分比与土壤AgNPs含量呈正相关,酸杆菌门、放线菌门的群落丰度百分比与AgNPs含量呈负相关。高剂量AgNPs暴露下土壤微生物群落中的α-、β-、γ-、δ-变形菌纲丰度在细菌纲水平丰度高于对照组。酸杆菌纲发育分类下的目、科、属在各分类水平群落丰度百分比均属于绝对优势丰度菌群,且各发育水平下的群落丰度百分比和土壤AgNPs剂量呈负相关。2.实验室纯培养条件下研究AgNPs对土壤硝化作用强度,采用实时荧光定量PCR(qPCR)测定AgNPs对土壤硝化功能基因amoA、Arch-amoA基因拷贝数的影响;利用氨氧化细菌模式菌株欧洲亚硝化毛杆菌Nitrosomonas europeae研究AgNPs对土壤硝化细菌活性抑制的机理,将N.europeae接种到含有不同剂量、尺寸AgNPs的培养基中探究对细菌抑制程度的影响。研究结果表明,土壤暴露在AgNPs环境中对土壤硝化作用产生抑制,土壤硝化反应的抑制程度和AgNPs暴露剂量呈正相关,其中土壤AgNPs含量分别为50mg/kg和100 mg/kg时AgNPs对该暴露剂量下的土壤硝化作用抑制率组间差异不显著。土壤AgNPs暴露剂量分别为10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg时,AgNPs对土壤微生物硝化功能基因amoA基因表达量的抑制率分别为34.4%、68.8%和91.8%,即土壤AgNPs含量100 mg/kg时对硝化作用抑制率极显著。N.europeae接种到含AgNPs(50 nm)的培养基中发现其亚抑制作用的浓度范围为5-10 mg/L,且在此浓度范围培养5-8 h时AgNPs对细菌所产生抑制率下降,即在此培养时间段内N.europeae细胞活性缓慢恢复;当N.europeae暴露在AgNPs剂量为20 mg/L的培养基中时对细菌活性抑制率高达77%,且抑制率不随培养时间变化。采用流式细胞(FCM)技术测定不同剂量、粒径AgNPs对N.europeae细胞致死率的影响,结果表明AgNPs(50 nm)所释放出的Ag~+导致细胞坏死率占该剂量AgNPs所引起细胞坏死率的45%;通过透射电镜-能谱仪(TEM-EDS)检测发现AgNPs粒子可穿透细胞膜进入细胞内部,与细胞结构紧密吸附结合造成细胞损伤;在同剂量下AgNPs粒子的尺寸越小,导致的细胞坏死率越高,小粒径AgNPs在低剂量时能显著影响细胞坏死率。3.通过稀释平板计数法测定AgNPs暴露下土壤可培养氨化细菌、反硝化细菌的数量,并测定AgNPs对蛋白酶活性、土壤反硝化功能基因nos Z基因拷贝数的影响;将反硝化模式菌株反硝化无色杆菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞单菌Pseudomonas stutzeri分别接种到含AgNPs的培养基中,探究AgNPs对反硝化细菌的影响。研究结果表明,暴露在AgNPs环境中的土壤可培养氨化细菌数量及蛋白酶活性均受到抑制,可培养氨化细菌数量及酶活性抑制程度与土壤AgNPs暴露剂量呈正相关。AgNPs对土壤可培养反硝化细菌数量、nosZ基因拷贝数均未产生显著抑制作用,即土壤反硝化细菌对AgNPs具有强烈的抗性。反硝化无色杆菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞单菌Pseudomonas stutzeri分别接种到含AgNPs的培养基中培养24 h,当培养基中AgNPs剂量为5 mg/L时通过扫描电镜(SEM)观察到两种菌体表面均形成紧密的荚膜,且此剂量下对细菌生长无抑制作用;当培养基中AgNPs剂量为20 mg/L时,两种菌体表面形成紧致的荚膜层,且通过透射电镜(TEM)观察到Achromobacter denitrificans的细胞膜完整,对细菌生长抑制不显著。4.实验室纯培养条件下批量实验处理,测定AgNPs剂量分别为10、50、100mg/kg时土壤硝酸还原酶、亚硝酸还原酶随时间酶活性的变化;通过施加无机氮肥CO(NH_2)_2、(NH_4)_2SO_4、KNO_3探究AgNPs对土壤氮素转化酶活性的影响;在AgNPs暴露下的土壤分别施加秸秆和猪粪,探究AgNPs对土壤有机氮肥转化的影响;基于~(15)N稀释技术测定不同剂量AgNPs暴露下对土壤氮初级硝化速率及矿化速率的影响。研究结果表明,当土壤暴露在AgNPs的培养条件下时,硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性与土壤AgNPs暴露剂量呈负相关。土壤AgNPs含量为10 mg/kg时,硝酸还原酶活性未受抑制;当土壤AgNPs含量100 mg/kg时,硝酸还原酶活性抑制显著。土壤AgNPs暴露剂量为50 mg/kg和100 mg/kg时,硝酸还原酶及亚硝酸还原酶活性与对照组相比抑制显著,但处理组间抑制程度相当。通过施加无机氮肥CO(NH_2)_2、(NH_4)_2SO_4可促进暴露在AgNPs环境中土壤脲酶的活性,其酶活性依旧受到AgNPs的抑制作用;暴露于AgNPs环境中的土壤施加KNO_3、CO(NH_2)_2对硝酸还原酶均有一定促进作用;施加CO(NH_2)_2及(NH_4)_2SO_4在未添加AgNPs及低剂量AgNPs(10 mg/kg)处理土壤中,对亚硝酸还原酶活性无显著促进作用;AgNPs暴露条件下的土壤,施加KNO_3促进羟胺还原酶活性。在土壤AgNPs暴露剂量为100mg/kg的条件下分别施加秸秆和猪粪,暴露在AgNPs环境下的土壤NH_4~+-N、NO_3~--N含量均低于分别仅施加秸秆和猪粪的处理组土壤,即AgNPs抑制土壤分解细菌的活性,使得有机氮肥施加后不易被分解成无机氮。在培养初期2 h-3 d时,土壤氮初级硝化速率及土壤氮初级矿化速率和AgNPs暴露剂量呈负相关;培养后期的部分培养时间段AgNPs处理组转化速率略高于对照组。在2 h-1 d培养时间段,土壤空白对照组的氮初级矿化速率分别高于土壤AgNPs含量为10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的9.3%、22.63%和34%,氮初级矿化速率分别高于24.1%、62.3%和82.2%。在AgNPs暴露下的土壤施加NH_4NO_3,土壤中NO_3~--N含量与AgNPs剂量呈负相关,表明AgNPs剂量和土壤硝化作用抑制率呈正相关。施加NH_4NO_3使对照组及AgNPs剂量为10 mg/kg土壤amoA和Arch-amoA基因拷贝数增加,AgNPs剂量为50 mg/kg和100 mg/kg时其基因拷贝数受AgNPs抑制而数量减少。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TB383.1;S154.3
【图文】：

图 1-1AgNPs 进入土壤环境后的迁移转化[31]Fig.1-1 The entry, transport, and fate of engineered nanoparticles in environmentAgNPs 的溶解对很多生物体均会产生毒性，如细菌、无脊柱动物、部分鱼类和人体某些器官及细胞[32]，但毒性作用的大小和 AgNPs 的剂量呈正相关，另外AgNPs 胶体稳定性、生物可利用性、化学性质的变化及在土壤环境中的迁移转化均是影响对生物体毒性大小的原因[33]。AgNPs 迁移行为很大程度上依赖土壤介质迁移转化和 AgNPs 形态，例如 PVP 包被 AgNPs 的迁移性和 pH、阳离子交换量、有机质含量呈正相关，而铁氧化物、钙和钾使得 AgNPs 迁移能力减弱[34]。纳米材料因比表面积大，易被其他物质吸附导致在环境中更加容易被迁移，大多数胶体表面为负电荷和带正电荷的纳米材料产生静电吸引和配位体交换。土壤中存在溶解态有机质如胡敏酸和富里酸，这些有机物使得 AgNPs 胶体稳定性增加[33,35]，胡敏酸包被的纳米材料具有空间稳定性并吸附腐殖质酸增加渗透力[36]。胡敏酸包被的纳米氧化物很容易在溶液中悬浮分散[37]，但 AgNPs 在胡敏酸包被时稳定性增加，减少在土壤介质中迁移转化的风险[33]。纳米材料在土壤环境的迁移、沉积受到

图 1-2 纳米颗粒对细胞毒理的不同作用机制Fig 1-2 Schematic representation of bacterial cell with different potential interactions of engineered nanoparticles andmodes of toxicity[31]AgNPs 的抑菌机理被认为和氧化应激有关，但氧化应激反应也能引起细菌的促炎反应。AgNPs 在细胞外和细胞内均可能产生 ROS，其产物羟基自由基被认为是导致白念珠菌 Candida albicans 线粒体功能失调，细胞凋亡的重要原因[70]。Ag+介导下对细胞的呼吸链造成干扰增加 ROS 产生量，其主要诱导产生形式是超氧游离基而不是 H2O2[71]。AgNPs 所引起氧化应激反应影响可由细胞关键蛋白表达量进行评估。通过添加维他命 C（VitC）和 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可减轻由 AgNPs 所引起的氧化损伤[72]。经过 NAC 预处理人体肺部上皮细胞 A549 可以减少 AgNPs 对细胞抑制能力，而且会改变基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）活性，同时也证明了 AgNPs 对细胞的毒性是通过依赖诱导产生 ROS 的途径作用[73]。另外研究证实，维他命 C 也能减少 AgNPs 造成慢性骨髓性白血病细胞的毒性[74]，这些研究结果都表明了 AgNPs 诱导细胞毒性的过程中氧化损伤起到了重要作用。

图 2-1 透射电镜观察 AgNPs 形态（50 nm）Fig. 2-1 Transmission Electron Microscope (TEM) images of silver nanoparticles (50 nm)土壤 DNA 提取采用试剂盒 FastDNATMSPIN Kit for soil，购于美国 MP 公司。胶回收试剂盒：TakaraAgarose Gel DNAFragment Recovery Kit Ver.2.0无乙醇氯仿：氯仿与水按体积比 1:2 装入分液漏斗中，摇晃混匀 1 min 后释放出底层氯仿放置在烧杯中，洗涤三次。纯化后的氯仿储备在玻塞棕色瓶中，避光 4℃保存。0.5 mol/L K2SO4溶液：87.10 g K2SO4溶于 1000 mL 去离子水定容。乙酸锂（LiOH·H2O）溶液：168 g LiOH·H2O 加入 279 mL 优级纯冰乙酸溶解并加水定容至 1000 mL，用 50%（w/v）NaOH 溶液或者浓盐酸调节 pH 至 5.2。茚三酮溶液：50 mL 乙酸锂溶液和 150 mL 二甲基亚砜（C2H6OS）混合后分别加入 0.12 g 还原茚三酮（C18H10O6·2H2O）和 4 g 水合茚三酮（C9H4O3·H2O）搅拌至溶解。0.1 mol/L 硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：(NH4)2SO4105℃干燥 2h 后放置在干燥皿

【参考文献】

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本文编号：2769795