牛粪堆肥中厌氧氨氧化菌的群落结构和多样性研究

发布时间：2020-08-17 18:38

【摘要】：堆肥技术作为处理废弃物有效方法,解决了畜禽粪便直接排放到环境中,对环境造成污染及占用空间等问题,同时达到资源合理利用的目的。氮的含量作为堆肥的重要指标,影响着堆肥质量,所以氮素转化是堆肥中非常重要的部分。厌氧氨氧化作用是在厌氧条件下使NH4+-N和NO2--N转变为N2的过程,属于氮素转化的一部分。厌氧氨氧化菌普遍存在多种环境中,理论上堆肥系统中也应该存在厌氧氨氧化菌,但是关于堆肥中厌氧氨氧化菌的报道却很少。本研究使用自制发酵罐进行堆肥,以模拟快速堆肥过程,来研究参与牛粪和稻秆混合堆肥中的厌氧氨氧化菌。通过堆肥样品理化指标的测定,应用克隆文库、聚合酶链式反应-梯度变性凝胶电泳(PCR-DGGE)、定量PCR的方法检测堆肥中的厌氧氨氧化菌,探讨厌氧氨氧化菌在牛粪堆肥过程中的群落结构、多样性及丰度的变化情况。本课题的研究将会进一步丰富堆肥氮素循环理论,同时为厌氧氨氧化菌的广泛分布提供理论依据。主要研究结果如下:(1)堆肥过程共进行30 d,在第3 d进入高温期(45℃),堆体于堆肥发酵的第5 d达到最高温58℃,堆体高温期持续8 d(3 d~10 d)。在整个堆肥过程中,p H值维持在8.0~9.0之间;含水率呈下降趋势,堆肥第29 d降至59.7%;C/N呈现下降趋势,在堆肥第29 d降到18.3;NH4+-N和NO3--N的含量变化呈相反的趋势,NH4+-N在堆肥高温期达到最大值(1640 mg/kg),之后随着堆肥的进行含量逐渐降低;NO3--N的含量在堆肥初期增长缓慢,在高温期后迅速增长,腐熟期达到最大值(1430 mg/kg)。随着堆肥天数的增加,种子发芽率指数逐渐上升,在第29 d,发芽率已经达85%以上,说明堆肥已完全腐熟。(2)应用克隆文库的方法检测堆肥中厌氧氨氧化菌,16S r RNA基因的克隆文库和hzo基因克隆文库的高百分覆盖率和趋于饱和的稀释曲线说明本研究所构建的克隆文库能代表该环境下大部分厌氧氨氧化菌的基因信息。克隆文库分析显示,在堆肥样品Day 7(高温期)和Day13(降温期)中厌氧氨氧化菌多样性相对较高,系统进化树分析显示堆肥中检测到的序列相似于Candidatus Scalindua、Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia属的厌氧氨氧化菌。聚类分析显示,温度或堆肥时间相近的样品群落结构更相似,且堆肥过程中厌氧氨氧化菌的群落随着堆肥进程发生了变化。(3)应用PCR-DGGE技术分析堆肥过程中厌氧氨氧化菌16S r RNA基因的群落变化。结果表明,各堆肥样品中均有优势条带产生。对引物Pla46f/Amx368r的DGGE图谱进行UPGMA聚类分析表明,各样品中之间的群落相似性在0.54~0.86之间;对引物Amx368f/Amx820r的DGGE图谱进行UPGMA聚类分析表明,各样品之间的群落相似性在0.35~0.84之间。对DGGE条带进行主成分分析,显示堆肥中厌氧氨氧化菌群落结构处于不断变化中,其中降温期样品Day 13与其它样品的群落结构差异较大。对优势条带回收测序后构建系统发育进化树,结果与克隆文库结果相似,主要相似于Candidatus Brocadia、Candidatus Scalindua、Candidatus Kuenenia三个菌属的厌氧氨氧化菌,在堆肥高温期主要优势菌相似于厌氧氨氧化菌属Candidatus Brocadia,综合比较两对引物检测后样品多样性结果,多样性较高的样品是Day 7(高温期)和Day 13(降温期)。(4)厌氧氨氧化菌16S r RNA基因的定量PCR结果,标准样品的质粒为3.68×109copies·μL-1,堆肥中各样品拷贝数在2.13×105~1.15×106copies·g-1之间,其中拷贝数最多样品的是Day 23(腐熟期),拷贝数最少的样品是Day 4(高温期)。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S141.4;Q93

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