椭圆食粉螨Hsp70基因的克隆及其在热胁迫下的表达研究

发布时间：2020-10-31 22:08

　　 椭圆食粉螨隶属粉螨科,是常见的储粮害螨,对人类经济及健康产生严重危害。椭圆食粉螨的种群动态受到温度的影响很大,超过适宜的温度范围就会造成热胁迫,热胁迫则会诱导其体内热激蛋白的表达来应对逆境。本文以椭圆食粉螨为材料,通过RT-PCR以及RACE技术克隆得到了椭圆食粉螨2个Hsp70基因cDNA的全长,并对其生物信息学进行分析,通过荧光定量PCR(RT-qPCR)技术探究Hsp70 mRNA在不同螨态及热胁迫下的表达水平,主要研究结论如下:1、克隆得到了椭圆食粉螨2条Hsp70的全长分别命名为:AoHsp70-1和AoHsp70-2,其中AoHsp70-1基因GenBank登录号为KX237517,cDNA的全长为2307 bp,其中开放阅读框(ORF)为1974 bp,编码657个氨基酸残基,蛋白质分子质量为71.92 KDa,等电点pI为5.27,其氨基酸序列包含3个Hsp70家族的签名序列,C-端存在GGXP 4肽重复序列,C-端末端存在胞质标志性基序EEVD,;AoHsp70-2基因GenBank登录号为KX237518,cDNA的全长为2623bp,其中ORF为1923 bp,编码640个氨基酸残基,蛋白质分子质量为70.64 KDa,等电点p I为5.56,其氨基酸序列包含3个Hsp70家族的签名序列,C-端末端存在胞质标志性基序EEVD,AoHsp70-1和AoHsp70-2它们的氨基酸序列都缺失信号肽切割位点,氨基酸序列中都含有6个N-糖基化位点,氨基酸序列都存在多处疏水区,预测的蛋白质三级结构包含N-端结构域(NBD)和底物结合域(SBD)两个结构域。多重序列比对的结果显示Hsp70具有高度的同源性,不同物种间氨基酸相似性在60%以上,通过NJ法构建系统树,结果显示AoHsp70-1和AoHsp70-2先聚为一支,然后再与其他螨类的Hsp70聚为一个大分支,其他所有昆虫的Hsp70聚为一个大分支。2、椭圆食粉螨在不同发育阶段(卵、幼螨、若螨及雌成螨)下其Hsp70的表达水平不尽相同,其中AoHsp70-1在雌成螨中表达水平略高于其他螨态,但是也没有显著性差异,而AoHsp70-2在若螨中表达水平最高,是对照组的5.01倍。低温胁迫下AoHsp70-1的表达水平没有显著差异,而AoHsp70-2的表达水平随着温度的降低而明显升高,并且在5℃时达到最大值为对照组的9.62倍,随着温度的进一步降低AoHsp70-2表达水平开始下降。高温胁迫下AoHsp70-1在不同温度下的表达水平没有显著性差异,而AoHsp70-2的表达水平随着温度的升高而明显升高,并且在39℃时达到最大值为对照组的23.97倍,随着温度的进一步降低其表达水平开始下降。AoHsp70-1和AoHsp70-2对热胁迫响应的不同说明:AoHsp70-1和AoHsp70-2分别是组成型和诱导型的Hsp70,说明诱导型的AoHsp70-2在椭圆食粉螨抗热胁迫中起到了关键性的作用,其在高温胁迫时比低温胁迫有更高的表达量,说明椭圆食粉螨可能对高温更加敏感。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S379.5;Q78
【部分图文】：

图 3-1 椭圆食粉螨总 RNA 提取情况电泳图gure 3-1 Total RNA agarose gel electrophoresis of守序列的扩增

椭圆食粉螨保守序列的扩增Figure3-2ConservativesequenceagarosegelelectrophoresisofA.ovatus

3-3 椭圆食粉螨 Hsp70-1、Hsp70-2 基因 5'RACE 和 3'RACE 扩增电泳图（从左到右依 Hsp70-1 基因 5'RACE、Hsp70-2 基因 5'RACE、Hsp70-1 3'RACE、Hsp70-2 基因 3'RACFigure 3-3 Agarose gel electrophoresis of 5'RACE and 3'RACE amplification for AoHsp70and AoHsp70-2(From left to right are 5 terminal sequence of Hsp70-1、5 terminal sequence oHsp70-2、3 terminal sequence of Hsp70-1 and 3 terminal sequence of Hsp70-2)
【参考文献】

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本文编号：2864567