玉米象是一种世界性仓储害虫,每年因玉米象的危害给人类造成重大的经济损失。目前市场上熏蒸剂如磷化氢、硫酰氟、溴甲烷等在玉米象的防治中发挥了巨大作用,但由于此类药剂长期大量不科学使用,导致玉米象产生了严重的抗药性,同时也加剧了对高等生物和大气环境的安全风险,限制了它们在储粮害虫防治上与管理中的持久应用。辣根素(AITC)是一种从植物中提取的异硫氰酸酯类化合物,具有植物源杀虫剂安全、低残留等优点,并对仓储害虫具有较好的熏蒸杀虫效果,被认为是一种潜在的植物源熏蒸剂。目前关于AITC杀虫机理尚无定论,明确AITC对仓储害虫的作用机制,有助于指导AITC高效、科学、合理使用。本研究以玉米象成虫为研究对象,在课题组前期研究基础上从基因克隆、载体构建与表达分析、蛋白纯化、同源建模与分子对接等几个方面开展试验工作,探索AITC对玉米象线粒体细胞色素c氧化酶(COX)核心亚基作用影响,研究取得的主要结果如下:1、玉米象成虫线粒体核心亚基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ基因克隆与序列分析。通过改进后的CTAB法提取玉米象成虫总RNA,经反转录合成第一链cDNA,结合RACE和RT-PCR策略克隆获得玉米象线粒体COXⅡ/Ⅲ的开放阅读框(ORF),并获得了COXⅡ登录号:GenBank KX783028。生物信息学分析表明,COXⅠ基因的ORF为1542 bp,编码513氨基酸(amino acid,aa),蛋白分子量(Molecular weight,Mw)为57061.12,理论等电点(Isoelectric point,pI)为6.33,起始密码子为AUU,终止密码子为UAA;COXⅡ基因的ORF为684 bp,编码227 aa,Mw为26237.88,pI为6.37,起始密码子为AUA,终止密码子为UAA;COXⅢ的ORF为792bp,编码263 aa,Mw为30938.1,pI为6.51,起始密码子为AUG,终止密码子为UAA。2、玉米象线粒体核心亚基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ载体构建与原核表达。对COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ三个核心亚基基因均构建了pET系列载体(pET28a、pET30a、pET32a、pET42a)和pEASYBlunt E1重组体,并成功转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。诱导后经SDS-PAGE和Western Blot(WB)验证,只有pET42-COXⅡ-E.coli BL21(DE3)、pET32-COXⅢ-E.coli BL21(DE3)得以表达,融合蛋白分子量分别为44kD和62kD,其中COXⅢ主要以包涵体形式存在,COXⅡ以可溶性形式存在上清液中。试验对pET42-COXⅡ-E.coli BL21(DE3)可溶性条件进行了优化,结果显示在温度16℃、IPTG为1 mmol L~(-1)、转速180rpm,诱导24h后上清液中COXⅡ含量最高,并通过Ni+-NTA柱对COXⅡ进行蛋白纯化以及浓度测定,测得COXⅡ蛋白浓度为50μg/mL。3、玉米象线粒体核心亚基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ在毕赤酵母GS115中的尝试表达。PP5软件设计含有EcoR I和Kpn I酶切位点的引物,经克隆、酶切、连接等构建了pPICZα-COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ重组表达载体,经双酶切和测序后,基因序列正确,无突变发生。用线性化酶Sac I对上述三个重组体进行线性化后,电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,成功构建转化子。4、玉米象线粒体核心亚基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ同源建模与分子对接。利用UV/Vis光谱分析了AITC对COXⅡ蛋白活性的影响,试验结果显示原核表达产物COXⅡ具有一定酶活,但活性较弱;结合IR光谱分析结果,证实AITC可能与COXⅡ蛋白在N-端或C-端发生了结合,致使波数发生了蓝移。研究选取与COXⅠ(同源率75%)、COXⅡ(同源率60%)、COXⅢ(同源率59%)同源率较高的蛋白牛心细胞色素C氧化酶(PDB ID:1V54)为模板,采用modeller 9.17软件对COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ进行三维结构模型构建。基于Autodock vina 1.1模拟平台,将AITC与COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ进行对接,结果表明AITC均可与三个亚基发生结合,其中AITC中的烯丙基位于COXⅠ氨基酸残基Phe-20、Ile-73、Ile-389、Ile-390、Phe-393和Phe-468组成的疏水性口袋中,AITC中硫原子与Gly-27形成键长为3.3?的氢键相互作用;AITC中的烯丙基位于COXⅡ氨基酸残基Ile-34、Pro-69、Ile-72和Leu-73所组成的疏水性口袋中,AITC中硫原子与Leu-31形成键长为3.4?的氢键相互作用;AITC中的烯丙基位于COXⅢ氨基酸残基Ile-63、Leu-81、Phe-235和Gly-236组成的疏水性口袋中,AITC中硫原子与Arg-223形成键长为2.8?的氢键相互作用。综合分析蛋白疏水性、氢键相互作用、范德华力等因素,AITC与COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ亲和力分别为-3.4 kcal/mol、-3.0 kcal/mol和-3.2 kcal/mol,故AITC对核心亚基的抑制活性顺序:COXⅠCOXⅢCOXⅡ。这与课题组前期利用RNAi技术,研究AITC对玉米象的作用结果相似,均对COXⅠ表现出较强的抑制效果。综上所述,本论文对玉米象三个核心亚基进行了基因克隆与生物信息学分析,获得玉米象COXⅡ/Ⅲ完整的开放阅读框,在此基础上,利用大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母表达系统对三个核心亚基进行了载体构建和尝试表达,SDS-PAGE和WB验证结果表明,只有COXⅡ以可溶性蛋白形式在原核体系中表达成功。通过优化诱导条件,对纯化后的COXⅡ蛋白进行了浓度分析和活性测定。最后,通过同源建模和分子对接,构建了三个核心亚基的三维结构模型,分析了与AITC相互作用位点。以上工作一方面为AITC对仓储害虫熏蒸作用机理深入研究奠定基础,另一方面为AITC类化合物的生物合理设计与合成提供参考。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S379.5
【部分图文】：
图 1-1 AITC对玉米象线粒体作用机理（张超 2016）Fig. 1-1 Effect of AITC on mitochondria of Sitophilus zeamais在的作用靶标
图 1-2 异硫氰酸酯类化合物潜在的作用靶标（Mi et al .2008）Fig.1-2 Protential major protein targers of ITCs期我们研究了 AITC 对玉米象的熏蒸致毒作用机理，研究结果表明，处理的玉米象成虫，其线粒体严重变形，内嵴稀少，集中密度降低，更部空泡化(Wu et al. 2014)。与此同时，AITC 对玉米象体内 CAT、GST
图 2-1 玉米象成虫总 RNA 提取结果. 2-1 The total RNA extracted from adult S. zeamaM:DNA 分子量标准 DL2000; L:总 RNAM:DNA Marker DL2000; L:The total RNA阅读框的扩增及序列分析放阅读框的扩增DNA 为模板，通过特异性引物 cox1-2F/ 2000bp 处有一条亮带，经测序，该条带6508）基因序列相似度为 99%。
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 郑旭;范锦胜;张李香;;玉米象生物生态学及防治技术研究进展[J];中国农学通报;2014年04期
2 梁英华;王登齐;;玉米种子仓储害虫玉米象的综合防治[J];现代化农业;2013年11期
3 高敏杰;史仲平;;甲醇营养型重组毕赤酵母高效表达外源蛋白过程的控制与优化(英文)[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2013年02期
4 王雪松;袁海滨;马丽滨;杨翠华;任炳忠;;植物精油与甲酸乙酯混配对玉米象成虫的熏蒸作用[J];东北师大学报(自然科学版);2012年03期
5 程小丽;武传欣;刘俊明;迟莹;魏庆伟;;储粮害虫防治的研究进展[J];粮食加工;2011年05期
6 邓树华;张志航;吴树会;陈渠玲;周剑宇;黄卫;;艾绿士对三种主要储粮害虫的毒力测定[J];粮食储藏;2011年04期
7 彭贝;王振华;靳勇;蔡万伦;华红霞;杨长举;高艮亮;;辣根素对3种仓储害虫的熏蒸作用[J];中国粮油学报;2011年06期
8 马玉花;赵忠;江志利;魏丽萍;李科友;马希汉;张兴;;苦杏仁精油对玉米象的种群抑制活性研究[J];中国粮油学报;2011年02期
9 颜崇银;陈占玉;;高大平房仓通风降温冷冻杀虫初探[J];粮食科技与经济;2010年03期
10 姚英娟;蔡万伦;杨长举;薛东;杨海生;;石菖蒲提取物与溴氰菊酯混配的联合毒力[J];华中农业大学学报;2007年01期
相关博士学位论文 前1条
1 张超;辣根素熏蒸对玉米象线粒体作用机理研究[D];西北农林科技大学;2016年
相关硕士学位论文 前4条
1 高远;玉米象（Sitophilus zeamais Motschulsky）试验种群生物学特性及生态学特征的研究[D];云南农业大学;2014年
2 彭贝;辣根素对主要仓储害虫熏蒸活性的研究[D];华中农业大学;2011年
3 吴华;辣根植物杀虫杀菌活性精油的提取及应用研究[D];华中农业大学;2007年
4 唐川江;防治仓储害虫的植物筛选及活性成分研究[D];四川大学;2002年
本文编号：
2876537
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nyxlw/2876537.html
