重组蛋白Puroindoline A对储粮霉菌的抑制作用及其稳定性研究
发布时间：2021-04-08 21:38
储粮霉变是造成粮食减损和品质下降的重要原因之一。灰绿曲霉是典型的低水分活度下活动的腐生霉菌,常被看作储粮早期霉变的“警示菌”。研究发现,Puroindoline蛋白（简称PIN蛋白）能够有效抑制许多植物病原菌的生长,对细菌和霉菌都具有明显的抗性。本课题组前期从小麦中克隆到Pina基因并在大肠杆菌中实现了表达。本文以此原核系统中表达纯化出的重组蛋白PINA（rPINA）为研究对象,考察其对主要储粮霉菌的抑菌作用及抑菌效果稳定性,着重研究了该重组蛋白对灰绿曲霉的抑菌效果和作用方式。主要研究结果如下:研究了重组蛋白PINA对白曲霉、黑曲霉、棕曲霉、禾谷镰刀菌和链格孢霉等五种常见储粮霉菌的抑菌作用。结果显示:在PDB培养基中,0.334 mg/m L重组蛋白PINA可在12 h内完全抑制白曲霉、黑曲霉、棕曲霉和禾谷镰刀的孢子萌发,部分抑制并延迟链格孢霉的孢子萌发;以PDA为培养基,当培养时间为4 d时,0.334 mg/mL重组蛋白PINA可显著抑制上述五种霉菌的菌丝生长。其中,对黑曲霉、禾谷镰刀菌和白曲霉的抑制率分别达到73.68%、89.13%和74.5%。对黑曲霉和棕曲霉的产孢能力也表现...
【文章来源】：河南工业大学河南省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PINA蛋白三维结构预测图[68]
河南工业大学学位论文13依据同样的方法测定重组蛋白PINA对白曲霉、棕曲霉、链格孢霉和禾谷镰刀菌菌丝的生长抑制效果。抑制率（%）=对照（空白）组菌落直径处理（实验）组菌落直径对照空白组菌落直径X100%2.3.5数据统计分析采用Excel对数据进行初步处理，然后利用软件SPSS22.0进行方差分析，p<0.01表示极显著，p<0.05表示显著。2.4结果与分析2.4.1重组蛋白PINA的表达纯化及WesternBlot检测本课题组前期将已构建的Pina基因的原核表达载体（PET28（+）+GST-Pina）转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行外源表达，当培养温度为30℃，IPTG终浓度达到9.6mg/mL，培养时间为12h的诱导条件下，较空白组而言，经转化后的大肠杆菌菌株全细胞在电泳图43KDa-55KDa区间内出现了一条明显的蛋白条带（图2-1），表明重组基因在大肠杆菌中已获得了表达[76]。图2-1重组蛋白PINA的SDS-PAGE分析[76]Fig2-1SDS-PAGEanalysisofrPINA泳道M：蛋白质Maker；泳道1：空质粒全细胞蛋白；泳道2：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌全细胞蛋白；泳道3：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的上清液；泳道4：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的沉淀
第二章重组蛋白PINA对主要储粮霉菌的抑制作用14随后对诱导表达后以包涵体为主要存在形式的重组蛋白进行纯化，最终得到可溶性重组蛋白PINA，如图2-2所示，经SDS-PAGE检测发现纯化后的蛋白液中存在一条分子量在44KDa的蛋白条带与蛋白的预期分子量基本一致。图2-2纯化后的重组PINA蛋白SDS-PANGE凝胶电泳分析[76]Fig2-2SDS-PANGEanalysisofpurifiedrPINA泳道M：蛋白质Maker；泳道1：空质粒全细胞蛋白；泳道2：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的上清液；泳道3：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的沉淀；泳道4-5：纯化后的重组蛋白PINAWesternBlot检测结果如图2-3所示，经纯化后的蛋白液仅有一条明显的特异性蛋白条带，表明已构建的Pina基因的原核表达载体特异性表达了重组蛋白PINA。本文作者采用课题组前期研究所得的此重组蛋白PINA，进行下述对储粮霉菌的抑制作用及其稳定性的相关研究。图2-3Blot检测重组蛋白PINA[76]Fig2-3WesternBlotdetectionofrPINA泳道M、N:蛋白质Maker；泳道1-3:重组蛋白PINA
【参考文献】：
期刊论文
[1]小麦中呕吐毒素研究进展[J]. 姜冬梅,王荷,武琳霞,王刘庆,王多,王蒙. 食品安全质量检测学报. 2020(02)
[2]乳酸菌素在动物生产上的应用[J]. 黄蕾茜,黄瑞玲,屈贵蜀,潘莞冰,杜美霖,王全溪. 福建畜牧兽医. 2020(01)
[3]家蝇抗菌肽AMP-17对白色念珠菌菌丝的抑制作用[J]. 赵欣宇,国果,苏佩佩,杨隆兵,朱丽娟,田竺青,付萍,彭建. 微生物学通报. 2020(03)
[4]水生动物抗菌肽的研究进展[J]. 胡丰晓,吴苗苗,张伟妮. 水产科学. 2019(06)
[5]贮藏期间粮食霉变控制方法的研究[J]. 冯蒙蒙. 食品安全导刊. 2019(15)
[6]三种天然防腐剂对五种常见微生物抑菌作用的研究[J]. 冯林慧,李迎秋,张鑫. 中国调味品. 2019(01)
[7]防霉剂在储粮中的应用研究进展[J]. 项芳芝,赵凯,邵倩,陶芳. 中国粮油学报. 2019(01)
[8]微生物抗菌肽在食品工业中的应用研究进展[J]. 陈亮,秦素雅,衡军影,王金水,卞科. 河南工业大学学报(自然科学版). 2018(05)
[9]抗菌肽的研究进展及在食品中的应用[J]. 陈伟,刘常金. 食品科技. 2018(04)
[10]链格孢引起的病害严重危害农作物生产并危及农产品安全[J]. 王婧,翟伟卜,高环,韩榕,齐放军. 植物保护. 2017(04)
博士论文
[1]Puroindoline基因与小麦籽粒硬度关系研究[D]. 李小燕.华中科技大学 2019
[2]肉桂醛对黄曲霉菌生长和产毒的影响机制研究[D]. 孙琦.中国农业科学院 2016
[3]凤仙透骨草抑菌活性成分、抑菌机理及对柑橘防腐保鲜效果的研究[D]. 曾荣.南昌大学 2012
[4]人工合成抗菌肽抑制棉花黄萎病菌的机制及应用研究[D]. 倪密.浙江大学 2012
硕士论文
[1]小麦赤霉病菌Rab互作溶酶体蛋白对DON毒素生物合成的影响[D]. 朱丽红.河南工业大学 2019
[2]抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对柑橘果实酸腐病的控制效果与机制研究[D]. 刘莎.西南大学 2019
[3]小麦PINA蛋白体外表达及其抗黄曲霉作用研究[D]. 吕昂.河南工业大学 2019
[4]储藏稻谷中霉菌的生长演替规律及霉变稻谷的品质研究[D]. 周涛.武汉轻工大学 2018
[5]银杏活性成分对苹果链格孢霉抑制作用的研究[D]. 徐志超.大连工业大学 2018
[6]鸡LEAP-2抗菌肽基因的克隆及蛋白的表达和纯化[D]. 李邹.山西农业大学 2016
[7]竹红菌甲素对番茄灰霉菌的抑制作用[D]. 李朋举.浙江农林大学 2014
[8]稻谷储藏中水分含量与霉变关系的研究[D]. 贠婷婷.内蒙古农业大学 2010
本文编号：3126323
【文章来源】：河南工业大学河南省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PINA蛋白三维结构预测图[68]
河南工业大学学位论文13依据同样的方法测定重组蛋白PINA对白曲霉、棕曲霉、链格孢霉和禾谷镰刀菌菌丝的生长抑制效果。抑制率（%）=对照（空白）组菌落直径处理（实验）组菌落直径对照空白组菌落直径X100%2.3.5数据统计分析采用Excel对数据进行初步处理，然后利用软件SPSS22.0进行方差分析，p<0.01表示极显著，p<0.05表示显著。2.4结果与分析2.4.1重组蛋白PINA的表达纯化及WesternBlot检测本课题组前期将已构建的Pina基因的原核表达载体（PET28（+）+GST-Pina）转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行外源表达，当培养温度为30℃，IPTG终浓度达到9.6mg/mL，培养时间为12h的诱导条件下，较空白组而言，经转化后的大肠杆菌菌株全细胞在电泳图43KDa-55KDa区间内出现了一条明显的蛋白条带（图2-1），表明重组基因在大肠杆菌中已获得了表达[76]。图2-1重组蛋白PINA的SDS-PAGE分析[76]Fig2-1SDS-PAGEanalysisofrPINA泳道M：蛋白质Maker；泳道1：空质粒全细胞蛋白；泳道2：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌全细胞蛋白；泳道3：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的上清液；泳道4：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的沉淀
第二章重组蛋白PINA对主要储粮霉菌的抑制作用14随后对诱导表达后以包涵体为主要存在形式的重组蛋白进行纯化，最终得到可溶性重组蛋白PINA，如图2-2所示，经SDS-PAGE检测发现纯化后的蛋白液中存在一条分子量在44KDa的蛋白条带与蛋白的预期分子量基本一致。图2-2纯化后的重组PINA蛋白SDS-PANGE凝胶电泳分析[76]Fig2-2SDS-PANGEanalysisofpurifiedrPINA泳道M：蛋白质Maker；泳道1：空质粒全细胞蛋白；泳道2：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的上清液；泳道3：转化PET28（+）+GST-Pina融合载体大肠杆菌破碎后的沉淀；泳道4-5：纯化后的重组蛋白PINAWesternBlot检测结果如图2-3所示，经纯化后的蛋白液仅有一条明显的特异性蛋白条带，表明已构建的Pina基因的原核表达载体特异性表达了重组蛋白PINA。本文作者采用课题组前期研究所得的此重组蛋白PINA，进行下述对储粮霉菌的抑制作用及其稳定性的相关研究。图2-3Blot检测重组蛋白PINA[76]Fig2-3WesternBlotdetectionofrPINA泳道M、N:蛋白质Maker；泳道1-3:重组蛋白PINA
【参考文献】：
期刊论文
[1]小麦中呕吐毒素研究进展[J]. 姜冬梅,王荷,武琳霞,王刘庆,王多,王蒙. 食品安全质量检测学报. 2020(02)
[2]乳酸菌素在动物生产上的应用[J]. 黄蕾茜,黄瑞玲,屈贵蜀,潘莞冰,杜美霖,王全溪. 福建畜牧兽医. 2020(01)
[3]家蝇抗菌肽AMP-17对白色念珠菌菌丝的抑制作用[J]. 赵欣宇,国果,苏佩佩,杨隆兵,朱丽娟,田竺青,付萍,彭建. 微生物学通报. 2020(03)
[4]水生动物抗菌肽的研究进展[J]. 胡丰晓,吴苗苗,张伟妮. 水产科学. 2019(06)
[5]贮藏期间粮食霉变控制方法的研究[J]. 冯蒙蒙. 食品安全导刊. 2019(15)
[6]三种天然防腐剂对五种常见微生物抑菌作用的研究[J]. 冯林慧,李迎秋,张鑫. 中国调味品. 2019(01)
[7]防霉剂在储粮中的应用研究进展[J]. 项芳芝,赵凯,邵倩,陶芳. 中国粮油学报. 2019(01)
[8]微生物抗菌肽在食品工业中的应用研究进展[J]. 陈亮,秦素雅,衡军影,王金水,卞科. 河南工业大学学报(自然科学版). 2018(05)
[9]抗菌肽的研究进展及在食品中的应用[J]. 陈伟,刘常金. 食品科技. 2018(04)
[10]链格孢引起的病害严重危害农作物生产并危及农产品安全[J]. 王婧,翟伟卜,高环,韩榕,齐放军. 植物保护. 2017(04)
博士论文
[1]Puroindoline基因与小麦籽粒硬度关系研究[D]. 李小燕.华中科技大学 2019
[2]肉桂醛对黄曲霉菌生长和产毒的影响机制研究[D]. 孙琦.中国农业科学院 2016
[3]凤仙透骨草抑菌活性成分、抑菌机理及对柑橘防腐保鲜效果的研究[D]. 曾荣.南昌大学 2012
[4]人工合成抗菌肽抑制棉花黄萎病菌的机制及应用研究[D]. 倪密.浙江大学 2012
硕士论文
[1]小麦赤霉病菌Rab互作溶酶体蛋白对DON毒素生物合成的影响[D]. 朱丽红.河南工业大学 2019
[2]抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对柑橘果实酸腐病的控制效果与机制研究[D]. 刘莎.西南大学 2019
[3]小麦PINA蛋白体外表达及其抗黄曲霉作用研究[D]. 吕昂.河南工业大学 2019
[4]储藏稻谷中霉菌的生长演替规律及霉变稻谷的品质研究[D]. 周涛.武汉轻工大学 2018
[5]银杏活性成分对苹果链格孢霉抑制作用的研究[D]. 徐志超.大连工业大学 2018
[6]鸡LEAP-2抗菌肽基因的克隆及蛋白的表达和纯化[D]. 李邹.山西农业大学 2016
[7]竹红菌甲素对番茄灰霉菌的抑制作用[D]. 李朋举.浙江农林大学 2014
[8]稻谷储藏中水分含量与霉变关系的研究[D]. 贠婷婷.内蒙古农业大学 2010
本文编号：3126323
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