土壤环境和宿主对黄芪根瘤菌分布及共生专一性影响的研究

发布时间：2024-03-01 03:52

　　蒙古黄芪(Astragalus mongholicus)和膜荚黄芪(A.membranaceus)是两种重要的中药材,统称为“黄芪”,其药用成份主要为黄芪多糖,有补气、抗衰老、提高免疫力的功效。由于黄芪在药物中的广泛应用,需求量越来越大,野生黄芪资源逐年匮乏,促使人们转向人工栽培。黄芪可与根瘤菌建立共生固氮关系,而人工栽培系统中黄芪共生根瘤菌的多样性尚没有系统研究,对于与黄芪共生的根瘤菌的宿主选择机制也不清楚。本论文首次对我国人工黄芪栽培区黄芪的结瘤固氮情况及黄芪与根瘤菌的共生固氮作用进行了系统的研究。本研究调查了不同人工栽培生态区的黄芪结瘤情况,进行了根瘤采集和根瘤菌的分离,对分离到的根瘤菌进行了遗传和共生基因多样性分析,并对根瘤菌受土壤环境和宿主影响下的地理分布情况进行了分析。结果表明,人工栽培黄芪的结瘤数随着施肥量的增加而减少,施肥量多的区域,根瘤数量少,根瘤内非共生的内生菌占多数;施肥量少或不施肥的地方黄芪结瘤最好,根瘤内以可结瘤固氮的中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)为优势菌,以北方中慢生根瘤菌(M.septentrionale)、温带中慢生根瘤菌(M.temper...

【文章页数】：138 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词一览表
第一章 绪论
    1.1 中国中药材黄芪的种植概况
    1.2 固氮作用
        1.2.1 工业固氮
        1.2.2 大气固氮
        1.2.3 生物固氮
    1.3 根瘤菌与豆科植物
        1.3.1 根瘤菌的分类
        1.3.2 根瘤菌与豆科植物的识别
        1.3.3 根瘤的形态
        1.3.4 膨胀型类菌体和非膨胀型类菌体
        1.3.5 结瘤相关的化学信号分子
        1.3.6 固氮有效性
    1.4 黄芪的根瘤菌多样性
        1.4.1 RFLP限制性酶切片段多样性分析
        1.4.2 Biolog唯一碳源利用
    1.5 基因组学
        1.5.1 测序技术的发展
        1.5.2 结构基因组学
        1.5.3 功能基因组学
        1.5.4 基因组学技术在根瘤菌中的应用
    1.6 转录组学
    1.7 根瘤菌剂的国内外应用现状
        1.7.1 根瘤菌剂的生产
        1.7.2 根瘤菌剂的应用
    1.8 本论文研究目的
    1.9 本研究的研究内容和意义
    1.10 技术路线
第二章 地理环境对黄芪根瘤菌的物种分布的影响
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 根瘤的采集
        2.2.2 培养基配方及化学试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 根瘤菌的分离纯化和保藏
        2.3.2 DNA提取
        2.3.3 16S rDNA基因扩增及限制性片段长度多态性分析
        2.3.4 IGS基因扩增及限制性片段长度多态性分析
        2.3.5 回接实验
        2.3.6 代表菌株16S rDNA,持家基因的扩增及系统发育分析
        2.3.7 结瘤基因nodC和固氮基因nifH的扩增及系统发育分析
        2.3.8 采样点土壤因子分析
        2.3.9 根瘤菌物种分布于土壤因子相关性分析
        2.3.10 GenGIS生物地理分布作图
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 中国主要黄芪种植生态区的根瘤菌样品菌株分布图
        2.4.2 16S rDNA限制性内切酶RFLP指纹图谱分析
        2.4.3 16S rDNA与IGS限制性内切酶RFLP指纹图谱合并分析
        2.4.4 16S rDNA序列系统发育分析
        2.4.5 持家基因序列合并系统发育分析
        2.4.6 结瘤基因nodC与固氮基因nifH系统发育分析
        2.4.7 回接实验结果分析
        2.4.8 土壤理化性质物种多样性及相关性分析
        2.4.9 中国主要黄芪种地地区根瘤菌多样性及其与宿主的关系
第三章 黄芪根瘤内生细菌新种的鉴定
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株信息
        3.2.2 培养基配方
        3.2.3 化学试剂
        3.2.4 参比菌株信息
    3.3 实验方法
        3.3.1 DNA提取
        3.3.2 16S基因的扩增及分析
        3.3.3 持家基因序列扩增及合并序列的分析
        3.3.4 结瘤基因nodC及固氮基因nifH的测序及序列分析
        3.3.5 全基因组测序、组装
        3.3.6 基因预测及注释
        3.3.7 全基因组ANI值计算及(G+C)含量分析
        3.3.8 脂肪酸成分分析
        3.3.9 唯一C源利用及表型性状测定
        3.3.10 BOX指纹图谱分析
        3.3.11 回接及交叉结瘤实验
        3.3.12 代时测定
        3.3.13 扫描电镜观察
    3.4 结果与分析
        3.4.1 16S rDNA基因系统发育分析
        3.4.2 持家基因系统发育分析
        3.4.3 结瘤基因nodC和固氮基因nifH的系统发育分析
        3.4.4 全基因组ANI值计算
        3.4.5 脂肪酸主成分分析
        3.4.6 唯一碳源利用及其它表型测定
        3.4.7 BOX指纹图谱分析
        3.4.8 回接实验及交叉结瘤结果
        3.4.9 代时测定
        3.4.10 扫描电镜结果
        3.4.11 结论
第四章 与黄芪特异性共生的根瘤菌全基因组分析
    4.1 引言
    4.2 实验材料
    4.3 实验方法
        4.3.1 全基因组DNA的提取
        4.3.2 全基因组测序和组装
        4.3.3 基因预测和注释
        4.3.4 16S rDNA系统发育分析
        4.3.5 核心基因组、附属基因组及泛基因组分析
        4.3.6 与宿主选择性相关的共生岛基因排列
        4.3.7 与黄芪共生的菌株特有基因分析
        4.3.8 山羊豆族共生菌株特有基因数据库注释(COG、KEGG、nr)
        4.3.9 山羊豆族共生菌株特有基因蛋白结构预测
        4.3.10 黄芪共生根瘤菌nodO基因的普适扩增
        4.3.11 nodO基因进化分析
        4.3.12 R.yanglingense CCBAU 01603的nodO敲除
        4.3.13 nodO删除突变体的共生表型验证
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 DNA样品检测
        4.4.2 全基因组序列组装及预测结果
        4.4.3 16S系统发育分析
        4.4.4 核心基因家族、泛基因家族分析
        4.4.5 共生基因结构
        4.4.6 与山羊豆族宿主特异性共生的根瘤菌特有基因分布
        4.4.7 nodO通用引物的扩增
        4.4.8 nodO基因的系统发育分析
        4.4.9 nodO删除突变株共生表型
第五章 黄芪与不同根瘤菌的共生匹配性分析
    5.1 引言
    5.2 实验材料和方法
        5.2.1 固氮酶活性测定
        5.2.2 差异基因分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 两株根瘤菌与黄芪的共生表型比较
        5.3.2 固氮酶活测定
        5.3.3 根瘤电镜切片
        5.3.4 CCBAU 01550和CCBAU 45272比较基因组学分析
        5.3.5 转录组数据拼接及差异表达基因分析
第六章 高效根瘤菌对黄芪的促生效果研究
    6.1 绪论
    6.2 实验材料和方法
        6.2.1 蛭石条件下与黄芪的共生研究
        6.2.2 野外土壤环境条件下与黄芪的共生研究
        6.2.3 恒山山脉的种植试验
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 蛭石及土壤条件下的接种试验
        6.3.2 大田应用中的蘸根移栽接种试验
结论和展望
附录
参考文献
致谢
个人简介



本文编号：3915397