重离子束诱变选育绿色木霉及其产纤维素酶的研究

发布时间：2020-03-28 15:38

【摘要】：随着化石能源的日益枯竭和全球能源危机的加剧,可再生资源受到了广泛的关注。木质纤维素类材料作为地球上储量最丰富的可再生生物质资源之一,对其加以有效的利用可缓解全球能源危机。纤维素酶是一组能够高效水解纤维素并生成可发酵糖的复合酶系的总称,由于酶解反应过程条件温和,易于控制,对环境无污染等优点己被广泛地应用于造纸、纺织、酿酒、食品、饲料、环保等多个行业。但是目前纤维素酶的开发应用仍面临着诸多问题,主要表现在纤维素酶生产菌株的生产性能不佳、酶的水解能力低下、下游分离工作繁琐、生产成本高等问题,严重阻碍了纤维素酶行业的快速发展。所以,本论文主要采用了重离子束对绿色木霉孢子悬液进行辐照诱变以选育优良的纤维素酶生产菌株,并进行了高活性纤维素酶突变株的纤维素酶发酵工艺优化,同时应用形态工程学技术对绿色木霉突变株的菌丝形态及相关代谢进行了初步研究,以探讨发酵工艺和菌丝形态对纤维素酶活性的影响。主要研究结果如下:1、重离子束辐照诱变绿色木霉及高活性纤维素酶突变株的筛选利用不同剂量的重离子束辐照绿色木霉My的孢子悬液,绿色木霉的重离子束辐照效应研究结果显示,重离子束辐照绿色木霉的半致死剂量为120 Gy,辐照的剂量为400 Gy时,孢子的存活率降至9.43%,正突变率在40 Gy,160 Gy时高于负突变率,分别为18.52%,24%,在160Gy剂量下有助于高活性纤维素酶菌株的筛选。重离子束辐照后,通过平板水解圈法初筛、24孔深孔板复筛和摇瓶发酵复筛,最终在160 Gy的辐照剂量下筛选获得一株高活性纤维素酶突变株My160-5,该菌株在液体摇瓶发酵120 h后,其滤纸酶活(FPA)和内切葡聚糖酶活(EG)均高于原始菌株。My160-5的FPA和EG酶活达到了532.81 U/mL,875.15 U/mL,与出发菌株酶活相比分别提高了20.54%,24.4%(P0.01);对突变株My160-5进行斜面传代培养9代,结果表明菌株的遗传稳定性良好。2、绿色木霉高活性纤维素酶突变株My160-5的产酶发酵工艺优化为了提高优良生产菌株的纤维素酶活力,本部分实验以诱变获得的绿色木霉高活性纤维素酶突变株My160-5为研究对象,采用Plackett-Burman(PBD)实验设计和响应面分析法(RSM),对生产菌株的纤维素酶摇瓶发酵工艺进行优化。结果显示利用Plackett-Burman实验设计从影响纤维素酶发酵的9个优化参数中筛选出了初始pH值、CMC-Na和蛋白胨三个显著影响因素,然后采用Box-Behnken(BBD)实验设计和响应面分析法进行后续优化,最终优化得到的纤维素酶最佳发酵条件为:CMC-Na 11.25 g/L,初始pH 4.25,蛋白胨6.5 g/L,装液量为20%,(NH_4)_2SO_4 2.1g/L,KH_2PO_4 2g/L,Tween 80 1ml,发酵温度30℃条件下发酵5天,在最优的发酵条件下,经过验证实验得到的最高滤纸酶活为628.36 U/m L,相比原始发酵水平提高了17.93%(P0.01)。3、绿色木霉高活性纤维素酶菌株液体发酵中的菌丝形态调控研究利用形态工程学技术,借助微粒在流场中的作用来研究绿色木霉菌株My160-5的菌丝形态对纤维素酶活性及菌体生长的影响。结果显示在添加了不同浓度的微粒后,绿色木霉菌株的菌丝形态发生显著变化,随着添加微粒浓度的增加菌球直径显著降低,在特定的菌球形态下FPA和EG酶活都显著提高。添加浓度为10 g/L时,滤纸酶活和内切葡聚糖酶活与对照相比分别提高了17.1%和13.3%。此外,根据菌球直径随着添加浓度的变化规律拟合了菌球直径预测的数学函数模型,通过应用形态工程学技术和数学建模手段来定向地控制绿色木霉的菌丝生长形态及发酵产酶活性,为纤维素酶的生产提供新的思路。
【图文】：

木质纤维素,生物质

图 1.1 木质纤维素生物质的结构和组成[9]Figure 1.1 Structure and composition of lignocellulosic biomass木质纤维素具有十分复杂的结构组织，首先纤维素与半纤维素相互联结，然后木质素穿插其中形成复杂的三维网架结构。如图 1.1 所示，三者之间主要通过化学键、氢键和范德华力的相互作用使木质纤维素结构紧密而不容易被水解利用。1.2.1.1 纤维素纤维素是由吡喃葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接形成纤维二糖分子[10]，再以纤维二糖为一个结构单元构成线性长链的纤维素大分子化合物（如图 1.2 所示）[11]。(n-2)/2

芥子醇,松柏醇,木质素,结构单元

半纤维素主要是由不同种类的糖构成的短侧链分支结构，包括糖酸、戊糖（木糖等）、己糖（葡萄糖等）等单糖类[15]，其含量在植物细胞壁成分中仅次于纤维素。半纤维素的结构组成在不同植物中存在着很大的差异，根据其分子结构和化学组成的差异可以分为甘露聚糖、木聚糖、木葡聚糖、以及混合糖苷键形成的葡聚糖等。通常在硬木本植物中，半纤维素主要以木聚糖的方式存在，而甘露聚糖则主要在草本植物中存在。半纤维素（无晶体结构，排列松散，机械强度低等）与纤维素由于在结构上的差异，前者更容易被水解利用[16]。此外，半纤维素与纤维素和木质素相比，对热化学处理的稳定性差，在热化学处理中，，其副官能团首先发生变构而参与反应，之后半纤维素骨架结构才参与热化学处理反应[17]。1.2.1.3 木质素木质素是木质纤维素中不能被水解利用的一类结构组分，其主要由松柏醇、对香豆醇和芥子醇三种醇单体（如图 1.3 所示）构成，是一种在结构上比较复杂
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925;Q93

【参考文献】