盐泽螺旋藻藻蓝蛋白β亚基在大肠杆菌中的重组生产及抗氧化性研究

发布时间：2020-04-06 17:19

【摘要】：螺旋藻藻蓝蛋白可以从天然的蓝藻中提取,也可以通过其它生物异源重组产生。研究表明,重组产生的藻蓝蛋白和天然藻蓝蛋白相比,具有相似的光谱特征,但表现出更强的抗氧化活性。基于从蓝藻中提取藻蓝蛋白复杂的分离纯化工艺,从大肠杆菌中合成生产藻蓝蛋白是更好的选择。本研究从盐泽螺旋藻Spirulina subsalsa FACHB351中PCR扩增藻蓝蛋白β亚基生物合成相关的编码基因(藻蓝蛋白β亚基编码基因cpcB、裂合酶编码基因cpcT和cpcS、藻蓝胆素合成酶编码基因ho?和pcyA),克隆到表达载体,构建表达质粒pETDuet-cpcB-cpcS::ho1::pcyA。转化表达质粒到大肠杆菌细胞,合成荧光藻蓝蛋白PCB-CpcB(C-82),最大吸收波长为620 nm,最大荧光发射波长为640 nm。当用cpcT代替cpcS时,则合成荧光藻蓝蛋白PCB-CpcB(C-153),最大吸收波长为590 nm,最大荧光发射波长为620 nm。本研究中采取单个质粒的表达策略避免多质粒转化的缺陷,减轻因抗生素的使用对环境造成的污染,降低生产成本,增加外源蛋白表达的稳定性。大肠杆菌具有周质空间,重组蛋白转移到细胞周质空间或者分泌到培养基中比胞内生产具有多项优势。本研究在藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白编码基因cpcB的N端融合pelB信号肽,与ho1、pebS和cpcS在大肠杆菌中共表达。结果表明可以合成重组藻蓝蛋白PelB::CpcB(C-82)-PEB,并分泌到培养基中。胞外收集的色素蛋白光谱特征和在胞内表达的基本一致,这表明其理化性质没有发生变化。藻蓝蛋白不需要细胞破碎而直接分泌到培养基中,节省生产成本。为了测试重组藻蓝蛋白脱辅基蛋白的抗氧化活性,本研究在大肠杆菌中表达Spirulina subsalsa、Mastigocladus laminosus和Nostoc PCC 7120藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白CpcB_(Sp)、CpcB_(Ma)和CpcB_(No)。通过测定它们对羟基自由基和DPPH自由基的清除率比较他们的抗氧化活性。结果显示:3种重组藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白都具有较高的抗氧化活性,对自由基的清除率都随着蛋白浓度的增加而上升。在被测定的浓度中,对羟基自由基和DPPH自由基的清除率都表现为CpcB_(Sp)㩳CpcB_(Ma)㩳CpcB_(No)。这表明脱辅基蛋白也具有很强的抗氧化能力,而不同藻种的藻蓝蛋白其抗氧化性表现出一定的差异。本研究进一步测试荧光重组藻蓝蛋白CpcB(C-82)-PCB和CpcB(C-153)-PCB对羟基自由基和DPPH自由基的清除率并评估他们的抗氧化能力。结果显示,CpcB(C-82)-PCB和CpcB(C-153)-PCB对羟基自由基的半清除浓度分别为38.72±2.48 ug/mL和51.06±6.74ug/m;对DPPH自由基的半清除浓度分别是201.00±5.86 ug/mL和240.34±4.03 ug/mL。重组蛋白的抗氧化能力表现为apo-CpcB㩳CpcB(C-153)-PCB㩳CpcB(C-82)-PCB,这与它们的色素结合率有关。荧光重组藻蓝蛋白具有比脱辅基蛋白更强的抗氧化效应,可开发为抗氧化试剂,在食品和医疗药物领域具有广泛的应用前景。
【图文】：

结构图,藻蓝蛋白,结构图,亚基

异构酶的作用下色素分子发生顺反异构的结果[15]。基和β亚基组成，每条亚基由PCB和相应的脱辅基蛋 β 亚基先形成(αβ)单体，再由 3 个(αβ)单体聚合形成叠形成六聚体(αβ)6，这些多聚体结合在一起组装形成白的 X 射线晶体衍射实验分析表明，PC 的晶体结构会影响PC在溶液中的存在形式。如，PC在接近其等PC 溶解于 pH=6.8 溶液中时，主要以三聚体存在。

藻蓝色素,胆绿素,亚铁血红素,生物合成途径

1.5 藻蓝蛋白的重组生产1.5.1 藻蓝蛋白的生物合成机理藻蓝蛋白的合成主要包括前后两步：首先是藻蓝色素的合成，其次是脱辅基蛋白在裂合酶的催化作用下与藻蓝色素的共价结合[61]。藻蓝色素是开环链状四吡咯色素分子，，通过硫醚键共价结合藻蓝蛋白脱辅基蛋白半胱氨酸残基，是蓝藻重要的光感受系统[61]。从起源的角度，藻蓝色素（PCB）来源于血红素（Heme）的代谢，并由胆绿素(Biliverdin IXa，BV)转化合成。PCB 的生物合成和叶绿素一样都是由氨酸乙酰丙酸开始。如果色素合成反应系统中存在 Mg2+螯合酶，则反应朝着叶绿素合成方向进行；如果色素合成反应系统中存在Fe2+螯合酶，则反应朝着合成血红素方向进行[62,63]。血红素氧化酶（HO1）氧化血红素，使其 C-5 共轭环开环断裂，生成胆绿素 BV。BV 在胆绿素还原酶（PcyA）的作用下还原成藻蓝色素[64]。血红素在动物、植物和微生物细胞中广泛存在。利用大肠杆菌本身含有的亚铁血红素，通过分子生物学和基因工程技术，向细胞中导入血红素氧化酶和胆绿素还原酶，亚铁血红素即可在血红素氧化酶的催化下转变成胆绿素，再在胆绿素还原酶的作用下最终合成藻蓝色素[65-67]。
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ93

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