肺炎链球菌3型荚膜多糖的寡糖蛋白缀合物和GPI结构的成孔毒素抑制剂的合成研究
发布时间：2020-04-09 21:25
【摘要】：细菌感染一直威胁着人类的身心健康,为了预防和治疗细菌感染所引起的疾病,人们采取了多种有效措施,但目前主要是使用抗生素类等抗菌药物来杀灭病原体。随着抗生素的不合理使用,出现了越来越多的耐药菌株。为了应对新出现的感染危机,人们需要研发更多、更有效的治疗方式。糖类化合物可以说是自然界中最丰富、结构最多样性的有机物。细胞糖萼是一层覆盖在细胞表面的糖质,它参与细胞分化、识别、粘附,甚至包括病理发展等多种生物过程。细菌荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)就是一类细胞糖萼,很多细菌的荚膜多糖不仅是其主要的毒力因子,荚膜多糖糖链结构的差异还是细菌分型的重要依据,而且很多荚膜多糖具有免疫原性、结构高度保守性,这些特点使其成为研制疫苗的理想靶标抗原。人们通过接种糖类疫苗来预防一些细菌的感染,例如肺炎链球菌疫苗、B型流感嗜血杆菌疫苗、C群脑膜炎球菌疫苗等都已上市应用,相比于抗生素,这些细菌糖类疫苗疫苗可以大规模接种,且接种后可长效防护。其中肺炎链球菌第一代疫苗是荚膜多糖疫苗,但是,单纯的荚膜多糖免疫原性较差,不能产生依赖于T细胞的免疫应答。为了解决该问题,人们将荚膜多糖与免疫原性较强的载体蛋白进行共价连接制备多糖蛋白缀合物,发展了第二代多糖结合疫苗。但上述两代细菌疫苗的多糖来源均为细菌提取,获得的荚膜多糖存在微观不均一、制备的糖蛋白缀合物存在质量不易控制等缺点,为了克服这些缺点,人们通过化学手段合成结构明确、糖链长短不一的荚膜多糖寡糖抗原,进而与载体蛋白相连制备糖蛋白缀合物,发展了第三代半合成疫苗,并且通过构效关系的研究,可确定出最佳的寡糖抗原结构。肺炎链球菌3型(SP3)是强致病性的亚型之一,它可引起成人侵袭性肺炎球菌病、坏死性肺炎和急性中耳炎。尽管SP3 CPS已经在肺炎十三价多糖结合疫苗(PCV13)中存在,但其CPS缀合物表现出较低的免疫球蛋白G(IgG)响应,影响了整个PCV13的保护功效。因此,本论文一个主要研究内容是以肺炎链球菌3型荚膜多糖为研究对象,制备系列具有明确抗原结构特征的SP3寡糖蛋白缀合物用于免疫活性评价:设计与合成了四个含有肺炎链球菌3型荚膜多糖重复片段的寡糖抗原(五、六、七、八糖);并将寡糖抗原与破伤风类毒素(TT)缀合得到寡糖蛋白缀合物候选疫苗;最后对制备缀合物的免疫活性和构效关系进行了初步的研究。研究还发现,许多细菌之所以致病,是由其分泌的成孔毒素引起的。这些成孔毒素是由细菌分泌产生的毒蛋白,它不仅仅是细菌的主要毒力和致病因子,还参与了细菌的生长和发育等过程。包括气单胞菌溶素和CAMP因子在内的成孔毒素能在宿主细胞表面形成孔状聚合物,并嵌入细胞膜内形成小孔,从而破坏细胞渗透屏障,导致反向离子交换和其他致命反应,最终杀死宿主细胞并导致疾病。但大多数的成孔毒素是亲水性的蛋白,并不含有明显的成孔结构,为了建立跨膜孔,成孔毒素通常与宿主细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合,从而形成孔状聚合物,并将聚合物插入至细胞膜中形成小孔。而GPI锚是一类天然糖脂,普遍存在于真核生物中,它通过将自身的脂质部分插入细胞膜的方式将蛋白质或糖蛋白固定在细胞表面。前期的研究结果表明,成孔毒素CAMP因子既能与GPI结合,又能与GPI结构片段结合,并且不含磷酸甘油脂的GPI衍生物能够抑制由CAMP因子导致的绵羊红细胞溶血现象。鉴于此,本论文另一个主要研究内容是筛选有效的基于GPI结构的成孔毒素抑制剂,主要包括:设计与合成一系列基于GPI结构的不同大小结构特征的衍生物;设计合成了基于氟硼二吡咯(BODIPY)荧光染料为标记探针的GPI衍生物,用于成孔毒素抑制剂的筛选。本论文主要包括以下三个部分:一、对肺炎链球菌3型荚膜多糖寡糖衍生物以及荧光或生物素标记的GPI锚衍生物的合成研究做了详细综述。肺炎链球菌3型荚膜多糖重复片段是由一分子糖醛酸和一分子葡萄糖以β-(1→4)键相连组成的二糖,由于分子中含有糖醛酸,其寡糖合成分为两种方式.①通过合理的保护基操作和组装策略,直接使用糖醛酸模块来构建糖链,最后脱除全部保护基得到目标化合物;②全部使用葡萄糖模块来构建糖链,然后选择性地裸露出需要转化为糖醛酸的葡萄糖模块6-OH,最后一步将所有的羟亚甲基(CH2OH)氧化为羧基(COOH)来实现糖醛酸的引入。而对于荧光或生物素标记的GPI锚衍生物的合成,主要是荧光分子或生物素衍生物中含有竣基,与GPI锚结构中额外的氨基以酰胺键相连,由于GPI锚结构中含有一分子氨基葡萄糖,在荧光分子或生物素与GPI锚缩合之前,氨基葡萄糖上自由的2-氨基先采用Boc保护基团保护,最后Boc保护基在缩合反应后用强酸脱除得到目标化合物。二、肺炎链球菌3型荚膜多糖相关寡糖及其蛋白缀合物的合成和免疫活性评价。我们以D-葡萄糖为起始原料,利用预活化糖苷化方法,首先构建了关键中间体二糖SP-10,利用SP-10来获得其他二糖和三糖模块,同时SP-10还起到延伸糖链的作用。通过[3+2]、[4+2]、[3+4]、[4+4]的组装策略成功构建了全保护五、六、七、八糖糖链,合成过程中充分利用苯甲酰基的邻基参与作用立体专一性地生成β糖苷键。选择性地裸露出葡萄糖基6-OH,一步将葡萄糖残基氧化成葡萄糖醛酸残基,最后脱除保护基得到目标化合物SP-(1-4)。通过交联剂琥珀酰亚胺戊二酸醋,SP-(1-4)分别与载体蛋白BSA和TT共价缀合得到一系列寡糖蛋白缀合物,其载糖量是通过基质辅助激光解吸飞行时间(MALDF-TOF)质谱仪测定载体蛋白缀合前后分子量的差值计算得来。SP3寡糖蛋白缀合物的初步免疫活性结果表明,它们都能引起依赖于T细胞的免疫应答,产生IgG抗体,并且五、六糖蛋白缀合物的免疫效果要显著强于七、八糖蛋白缀合物的免疫效果。三、GPI荧光标记物和基于GPI结构的成孔毒素抑制剂合成。我们分别以D-氨基葡萄糖和α-甲苷葡萄糖为起始原料,制得氨基葡萄糖供体GI-24和光学纯肌醇受体GI-38,进而偶联得到底座伪二糖GI-40。与此同时,以D-甘露糖为起始原料制备了甘露三糖供体GI-56。随后,采用[3+2]组装策略构建了全保护GPI核心伪五糖GI-57,紧接着在其Man-Ⅲ的6-O位引入磷酸乙醇胺、将氨基葡萄糖2-氨基以Boc保护基保护,催化氢化后的产物GI-62与含有羧酸长链的BODIPY衍生物GI-66在HATU[2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N',-四甲基脲六氟磷酸盐]作用下缩合。可惜的是,用酸性选择脱除Boc保护基的同时终产物失去了荧光性。我们又将Boc保护基替换成碱性脱除的Fmoc保护基,成功制得GPI荧光标记物GI-14和15。另一方面,以D-甘露糖为起始原料制备了Man-I的2-O位含有乙酰基的甘露单、二、三糖硫苷供体(GI-46、86、89),然后采用[1+2]、[2+2]、[3+2]组装策略构建了伪三、四、五糖(GI-90、95、100),脱除Man-1 2-O位乙酰基或肌醇1-O位对甲氧基苄基,紧接着磷酸乙醇胺化或单磷酸化。与此同时,将光学纯肌醇模块和伪二糖模块结构中肌醇1-OH单磷酸化,最后脱除保护基得到了一系列含有不同官能团、糖链长短不一的GPI衍生物GI-(1-13)。上述制备系列GPI化合物GI-(1-13)和两种GPI荧光探针GI-14、15为筛选有效的成孔毒素的抑制剂奠定物质基础。
【图文】：
而所有的蛋白或糖蛋白通过其肽链的Ｃ－端与ＧＰＩ描中甘露糖－ＩＩＩ上的６－０的逡逑磷酸乙醇胺的氨基以酰胺键相连，［６７］这样ＧＰＩ锚将蛋白或糖蛋白描定在相应的细逡逑胞膜表面（图１．９）。逡逑Ｈ逦0邋＋／－邋Ｓｕｇａｒ逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｎ＾＾0＿Ｈ＿0￣逡逑。？ｏ0＾＾Ｍａ？，ｎ逡逑Ｈ０、ｉ逡逑Ｈ0邋＾＾ｉ－0，邋Ｍａｎ－ｌｌ邋＋／－邋Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ逡逑＋／－邋Ｓｕｇａｒ邋＝５－邋ｈｏ逦＾逡逑0邋Ｍａｎ－１逡逑？／？Ｓｕｇａｒ邋０逦，0ｈ逦＋／－Ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ逡逑ＧＪｃＮ邋Ｕ逡逑ＨＯ邋ＯＨ逡逑ｈ３ｎ逦ｉｎｏｓｉｔｏｌ逡逑Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ逦0＝ｐ－0—Ｎ逦ｌｉｐｉｄｓ逡逑ｆｆｆ丽|!R铡Ｆ远义希茫澹慑危殄澹五澹湾澹慑澹湾澹″澹桑慑澹湾澹澹澹欤殄澹慑澹慑澹湾澹湾义希恚澹恚猓颍幔睿邋澹赍澹靛澹煎澹湾澹，
本文编号：2621279
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