拜氏梭菌耐氧突变及黄姜糖液发酵高产丁醇机理分析

发布时间：2020-04-14 06:28

【摘要】：生物丁醇因其优良特性成为备受关注的新型可再生燃料,同时,丁醇还是一种重要平台化合物、萃取剂和车辆刹车制动剂等。目前,生物丁醇主要来源于梭菌属(clostridia)细菌丙酮丁醇乙醇厌氧发酵(ABE发酵)。但是,相对于石油化工化学法来源的丁醇,生物丁醇发酵生产存在产量和效率偏低等问题,导致生产成本较高。因此,提高生物丁醇市场竞争力的核心是解决ABE发酵生产成本问题,通过调研分析,可从以下方面突破:1)增加菌株对氧的耐受性;2)提高溶剂产量和生产效率;3)降低溶剂对细胞的毒害;4)寻找廉价非粮发酵原料;5)提高菌株稳定性,使其优良特性不易退化。为此,本文选取拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)为对象,从增加菌株对氧的耐受性、提高溶剂产量和生产效率,以及廉价非粮原料发酵等方面深入研究,以期降低生产成本,并分析其高产机理。取得如下主要研究成果:(1)成功构建一株拜氏梭菌耐氧突变株(Cbei_1336 mutant),并发现其丁醇和丙酮的产量和产率显著提高。利用二型内含子插入法成功敲除拜氏梭菌产溶剂退化菌株(C.beijerinckii DS)中参与过氧化物还原机制调节的Per R抑制子基因Cbei_1336,获得一株耐氧的兼性厌氧突变株。该突变株不但可以在有氧环境中生长良好,且与出发菌株相比,发酵液中生物量提高8.11±0.11(OD600)(3.67±0.35倍),丙酮和丁醇浓度分别提高4.7±0.40 g/L(32.78±0.02倍)和10.01±0.57 g/L(57.23±0.01倍),总溶剂生产效率由产溶剂退化株的0.07±0.01 g/L/h提高到突变株的0.19±0.01 g/L/h,产率提高了2.71±0.01倍。(2)基于转录组学进一步分析了耐氧突变株(Cbei_1336 mutant)耐氧以及丁醇和丙酮产量和产率显著提高的分子机理。通过比较分析C.beijerinckii DS和Cbei_1336 mutant在发酵12h、24h和36h后细胞中的基因表达变化,发现3个时间点差异表达的基因分别有2893、2597和3036条,除去其中未知蛋白后,在3个时间点共同上调的有975条,共同下调的有222条。Gene Ontology(GO)分析显示,在共同上调和下调的基因中,参与代谢进程(Metabolic process)的基因比例均是最多的,分别占26.69%和29.28%。进一步的基因差异表达分析显示,编码ABE发酵代谢路径关键酶:mannitol transporter subunit IIB,6-phosphofructokinase,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,pyruvate kinase,2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase subunit beta,acetyl-CoA acetyltransferase,acetoacetate decarboxylas和NADPH-BDH等基因在Cbei_1336 mutant中显著上调,而编码phosphate acetyltransferase(PTA)和acetate kinase的基因在Cbei_1336 mutant中显著下调。此外,编码参与氧化还原进程的Ferredoxin,flavodoxin,rubrerythrin和radical SAM protein;编码参与细胞解毒的glutaredoxin,multicopper oxidase(MCO)和Superoxide dismutase(SOD);编码参与金属离子相关的能量代谢的iron-dicitrate ABC transporter ATP-binding protein,iron transporter(FeoB)和manganese transporter;编码参与孢子形成的small acid-soluble spore protein(SASP)和spore coat protein等基因在Cbei_1336 mutant发酵的3个时间点均显著上调,推测葡萄糖消耗和产溶剂进程、细胞解毒与氧化还原进程、金属离子转运和产孢进程可能在Cbei_1336 mutant的耐氧机制和高的溶剂产量和产率中发挥了重要作用。(3)研究发现作为黄姜淀粉糖化液(saccharification liquid of DZW starch,SLDS)是一种廉价非粮原料,可显著提高C.beijerinckii ABE发酵丁醇和丙酮的产量和产率。进一步分析发现,与传统P_2培养基相比,SLDS可有效提高C.beijerinckii ABE发酵的生物量,葡萄糖消耗量和消耗速率,以及溶剂丙酮和丁醇的生产量和生产速率,有效缩短发酵周期24h左右。通过qRT-PCR实验对比分析黄姜淀粉粗糖液和P2培养基发酵液中12h菌株基因表达,发现SLDS为底物的培养基中丙酮和丁醇产量和产率的提高与葡萄糖磷酸转移酶系统(Cbei_0242),丙酮酸激酶(Cbei_0485),乙酰乙酸脱羧酶(Cbei_3835),依赖NADPH的丁醇脱氢酶(Cbei_2181)和依赖NADH的丁醇脱氢酶(Cbei_2421)5个葡萄糖消耗和丙酮丁醇生产的核心代谢酶基因的上调表达相联系。SLDS是黄姜皂素产业的副产物,它的排放不仅会导致大量营养物质流失,而且还会给环境造成污染。因此,对SLDS的利用可降低ABE发酵生产生物丁醇的成本,还可以大幅减少环境污染和资源浪费。
【图文】：

趋势图,消费结构变化,世界能源,趋势图

黄姜淀粉糖液的具备以上优良特性，本文也对黄姜淀粉糖液的研究与利用现状进行了综述，并探讨了将其用于 ABE 发酵的可行性及前景。1.1 世界能源现状和未来发展趋势随着人类文明的进步和人类社会经济的飞速发展，人们对能源的需求和消耗越来越大。在国际能源署（International EnergyAgency，IEA）2014 年发布的报告《KeyWorld Energy Statistics 2014》中，对 1971-2012 年世界能源消费结构变化进行了总结（图 1-1），显示了人类对能源的需求日益攀升。图 2-1 显示，截止 2012 年世界能源需求量已经达到 13371 百万吨油当量（milloin tons of oil equivalent，，Mtoe），化石燃料仍然是全球能源消费的主体占（81.7%），其中，原油（Oil）占 31.4%，煤炭（Coal）占 29%，天然气（Natural gas）占 21.3%；另外，新型能源中，核能（Nuclear）占 4.8%，水电（Hydro）占 2.4%，生物燃料（Biofuels and waste）占 10.0%[1,2]。

基础能源,占有率,总量,能源

图 1-2 2012 年各种燃料在基础能源总量中的占有率（引自[1]）ure 1-2 Occupancy of various fuels in total primary energy supply in 2油公司（BPp.l.c，BP）在其 2015 年 2 月发布的《BP2035 世和人均收入增加是能源需求增长的关键因素，预计到 203，预示着增加了 16 亿需要能源的人口。其中，中国和印键驱动因素，到 2035 年，两国共占的人口和国内生产总值分别成为世界第一和第三大经济体。图 1-3 给出了 1965-2势来看，尽管到 2035 年化石燃料仍是主导性能源，但它年的 86%降至 81%；在非化石燃料中，包括生物燃料在内高，从 2015 年的 3%升至 2035 年的 8%，并在 2020 年超过3]。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ923

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