扭脱甲基杆菌产甲羟戊酸高密度发酵工艺研究

发布时间：2020-04-16 23:17

【摘要】：微生物细胞工厂是生产大宗化学品、生物燃料、天然产物的重要技术,其碳源选择是微生物制造工业发展的关键问题之一。甲醇基微生物细胞工厂能够以有机碳一甲醇为原料生产高附加值化合物,是解决糖基细胞工厂“与人争粮”和技术经济性的重要途径,因此研究甲醇基微生物细胞工厂构建及其发酵工艺具有重要意义。扭脱甲基杆菌AM1是能够以甲醇为唯一碳源和能源进行生长代谢的甲基模式菌株。本论文以AM1为宿主菌,以通过途径重构从甲醇合成甲羟戊酸为目标产物,为解决AM1发酵过程中溶氧不足导致难以实现高密度、影响甲羟戊酸产率的问题,通过在发酵过程中添加氧载体以及结合基因组途径工程表达透明颤菌血红蛋白的手段来解决溶氧限制问题,通过进一步将突变的QscR转录调控因子和mvt操纵子整合到pCM110质粒,构建了甲羟戊酸产量提升的工程菌株。进一步通过利用常压室温等离子体(ARTP)诱变结合实验室适应性进化,筛选得到了能够高耐受甲醇且能够稳定遗传的高产突变株。通过在摇瓶发酵过程中添加不同氧载体的策略,提高了扭脱甲基杆菌AM1的生长情况。当在扭脱甲基杆菌AM1发酵24h后,添加3%的十六烷时,扭脱甲基杆菌AM1的OD_(600)为12.56比不添加组提高19.9%。发酵120h,没有添加氧载体的对照组甲羟戊酸终产量143.7mg/L,添加十六烷组的培养体系甲羟戊酸终产量163.7 mg/L,添加十六烷使得甲羟戊酸产量提高了10%左右。通过基因工程在甲基菌AM1中整合vgb基因,也相应的提高了甲基菌AM1的生长能力。在pCM110质粒上表达带有甲醇脱氢酶启动子的vgb基因菌株AM1-Δcel/pCM110-P_(maxF)-vgb最高生长OD_(600)达到了19.84,而表达vgb天然启动子的菌株AM1-Δcel/pCM110-P_(vhb)-vgb最高生长OD_(600)达到了18.73。对照组AM1-dcel::mvt最高生长OD_(600)为10.06。在甲基菌基因组上表达vgb基因的两株菌AM1-Δcel::(P_(maxF)-vgb)和AM1-Δcel::(P_(vhb)-vgb)生长与对照菌株没有明显差别。同时,将QscR转录调控因子和mvt操纵子整合到pCM110质粒,在甲基菌AM1中的表达也提高了甲羟戊酸的产量。其在摇瓶中发酵144h的甲羟戊酸产量为387.65mg/L,是目前摇瓶产甲羟戊酸的最高产量。在5L罐甲醇流加补料中,AM1-Δcel/pCM110-P_(maxF)-vgb-mvt-qscr最高生长OD_(600)达到了38.56,是目前文献报道最高值,甲羟戊酸产量为1.03g/L。
【图文】：

2图 1-1 扭脱甲基杆菌以甲醇为底物的代谢网络图谱[10]随着人们对扭脱甲基杆菌AM1 各方面知识的了解和认识的深入，甲基营养菌的应用前景定会十分开阔。而M.extorquens AM1 作为生产运用的平台菌株，目前已经成功用于氨基酸、蛋白质、功能化的PHB、1-丁醇、蛇麻烯、甲羟戊酸等

安徽工程大学硕士学位论文多种化学品的生产，涵盖了生物能源、蛋白质、氨基酸等。本实验室前期研究者的工作是通过在M.extorquens AM1 中构建甲羟戊酸的代谢途径，并且运用多种代谢工程的方法组合优化了生产甲羟戊酸的菌株，，同时取得了一定的效果。目前，M.extorquens AM1 利用甲醇作为底物来生产高附加值产品的规模较小且产品远远不能达到工业化规模的要求。在M.extorquens AM1 的高密度培养工业化进程中，也只有英国帝国化学工业集团（ICI）用甲醇作为碳源，实现了单细胞蛋白的这一产品的工业化生产。我们知道，在M.extorquens AM1 大规模的高密度培养过程中，发酵过程中的溶氧和散热是关键性问题，也是限制性问题。能够解决好这些问题是成功运用M.extorquens AM1 生产高附加值产品的前体保障。
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ921

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 王爽;周巍;刘红冉;李永波;马超峰;张岩;;几种氧载体对纳他霉素发酵的影响[J];食品科学;2015年09期

2 朱艳;袁其朋;王航;;添加氧载体及表面活性剂对番茄红素发酵的影响[J];微生物学通报;2006年01期

本文编号：2630148