毕赤酵母GPI型蛋白缺失菌株文库的构建及其性能分析

发布时间：2020-04-16 23:37

【摘要】：酵母中GPI型蛋白是细胞生存和维持正常细胞形态所必需的一类蛋白。本研究为了深入了解毕赤酵母GPI型蛋白,构建了毕赤酵母GPI型蛋白缺失菌株文库并对其性能进行分析,通过表型筛选推测缺失蛋白可能的功能。对筛选到的一株甲醇耐受性缺失菌株,利用蛋白质组学和转录组学方法进行深入分析,了解菌株在甲醇胁迫条件下的响应特点及缺失蛋白的功能。同时利用固定化载体的疏水性显著影响脂肪酶活力的原理,从缺失菌株库中筛选表面疏水性显著提高的菌株以及疏水蛋白修饰细胞表面两种方法,有效改善脂肪酶的活力。具体研究内容及结果如下:(1)利用Cre/loxP重组酶系统,对毕赤酵母预测的50个潜在GPI型蛋白通过单基因敲除的方法,成功获得45株,构成毕赤酵母GPI型蛋白缺失菌株文库。对这些GPI蛋白缺失菌株进行性能分析,发现敲除的GPI型蛋白对细胞的生长都是非必需的。根据蛋白的缺失可能引起的细胞壁结构重构现象,从缺失菌株库中筛选出5株甲醇耐受性显著增加的菌株,4株细胞壁多糖含量显著提高的菌株以及4株表面疏水性明显提高的菌株,具有潜在的应用价值。(2)利用蛋白质组学分析方法对毕赤酵母的细胞壁蛋白进行深入分析,最终鉴定到毕赤酵母的164种细胞壁蛋白,并进行生物信息学分析,丰富了毕赤酵母细胞壁蛋白库信息。对甲醇耐受菌株gcw19△在甲醇胁迫条件下的细胞壁蛋白响应特点进行研究,发现有大量未知功能的蛋白,细胞壁相关蛋白,压力响应相关蛋白,蛋白合成及命运相关蛋白、代谢相关的蛋白以及和环境相互作用的蛋白都发生了显著变化。这些蛋白的响应和变化最终形成了菌株gcw19△在甲醇胁迫条件下新的表面蛋白系统,使菌株能够更好的适应环境。(3)利用转录组学分析方法全面了解甲醇耐受菌株gcw19△的基因表达情况。分析发现菌株gcw19△在甲醇胁迫条件下绝大部分预测到的GPI型蛋白,他们的基因转录水平都大幅度上调,引起了细胞表面蛋白的重构。此外菌株在氨基酸代谢途径中也变化明显,表现出有利于胞外氨基酸吸收进入胞内的特征,说明GCW19蛋白对氨基酸的吸收具有阻碍作用。通过实验验证也说明了菌株gcw19Δ对氨基酸的吸收利用强于对照菌株GS115。其他途径如细胞壁合成途径,细胞周期代谢途径,甾醇合成途径,蛋白质生物合成途径、细胞应激途径等也发现了差异变化基因,这些途径的共同调控使菌株gcw19△能够更好的适应甲醇胁迫的环境。(4)在GPI蛋白缺失菌株库中筛选得到菌株gcw13Δ,gcw22Δ,ku70Δgcw30Δ和ku70Δgcw53Δ,他们的细胞表面都表现出明显的强疏水特性。以这4株菌做为固定化载体,展示的脂肪酶CALB活力得到有效改善,其中菌株gcw22Δ/CALB-GCW61的酶活力在发酵120 h提高了69%。同时引入两种来源不同的真菌疏水蛋白SC3和HFBI修饰细胞表面,发现同样能提高细胞表面的疏水性特性,共展示脂肪酶时菌株GS115/HFBI-61/CALB-51表现出良好的表面疏水特性和脂肪酶活力,最终水解活力和合成活力分别提高了37%和109%。
【图文】：

细胞壁,甘露聚糖,绪论,微纤丝

第一章绪论第一章绪论细胞壁结构和组成概述细胞壁的结构胞是呈圆形或者卵圆形的单细胞真核生物，，直径为 3-5μm。细胞层，能够维持细胞的形态，在细胞与外界环境交流中发挥重要作母的细胞壁具有电子密度不同的两层结构，厚度为 110-200nm。形状类似刷子‖，是酵母的甘露聚糖蛋白层，能够通过蛋白水解密度较小，主要是一些微纤丝，能够被 β-葡聚糖酶消化，说明该的，电镜结果如图 1-1 所示。

葡聚糖,细胞壁,糖苷键,渗透压

华南理工大学博士学位论文酵母细胞壁各组分之间也相互联系，共同构成细胞壁的三维网状结构。其中主要通过 O-糖苷键和 N-糖苷键和甘露糖结合，最终形成酵母的细胞壁甘露细胞壁的很多甘露糖蛋白可以先通过共价键和细胞壁的 β-1,6 葡聚糖连接，6 葡聚糖与 β-1,3 葡聚糖相连，或者直接和 β-1,3 葡聚糖连接。还有一部分甘过氢键等非共价键或者二硫键和 β-1,3-葡聚糖相互连接。几丁质也可以通过的 β-1,4 糖苷键与 β-1,3 葡聚糖链的非还原末端连接，或者以 β-1,3-葡聚糖链连在 β-1,6 葡聚糖链上[7, 8]，细胞壁各组分的交联方式如图 1-2 所示。这些多相互交联方式形成的网状结构不仅为细胞壁提供了一定的机械强度，而且具性来应对外界环境的变化。例如正常渗透压条件下细胞壁可大量的延伸，当渗透压环境时，细胞壁结构可以在短时间内缩小至原来体积的 40%左右。当到正常的条件后，细胞壁结构又可恢复原状且细胞能够正常生活[9]。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ926

【参考文献】