一株杀松材线虫活性菌株筛选及活性成分分析

发布时间：2020-04-19 14:37

【摘要】：松树萎蔫病(Pine wilt disease,PWD)是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起,使松属植物快速枯死萎焉的一种毁灭性病害,严重威胁我国林业的发展。但是目前市场所应用的杀线药剂效果差、毒性强、残留高,因此应从自然界入手开发高效低毒的生物源药剂。内寄生真菌的次生代谢产物丰富并有良好的杀虫活性,可对其防治松材线虫的活性进行研究。本文通过四个部分确定活性菌株发酵液中毒杀松材线虫的活性化合物:从7株供试的内寄生真菌中筛选出对松材线虫毒性最强的高效菌株;活性菌株发酵滤液稳定性的测定;活性萃取物的提取、分离、鉴定以及马尾松松枝水培实验的研究。1.在室内条件下,采用浸渍法测定3株淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)和4株厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydospora)的发酵原液对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的毒杀活性,并通过生长速率法研究活性菌株的发酵滤液在不同条件下的稳定性。结果表明:淡紫拟青霉PT1菌株的发酵滤液对松材线虫的毒杀作用最强,处理72 h后松材线虫的校正死亡率高达88.37%。PT1菌株发酵滤液稳定性较好,表现出良好的热稳定性(除121℃C的极端高温环境);能够抵抗强酸强碱及紫外线照射;在氧化还原剂的影响下依然能保持稳定;但在金属离子测定中,Zn2+、Fe2+与Fe3+对发酵液稳定性影响较大。证明PT1菌株发酵液具有良好的稳定性能够保证其次生代谢产物不受破坏,显现了良好的研究价值和应用前景。2.通过不同萃取溶剂、不同萃取比例的筛选,得到杀线活性最强的萃取物。并运用薄层层析、硅胶柱层析及GC-MS分析的方法对活性菌株的高效萃取物进行提取、分离、纯化、鉴定。明确淡紫拟青霉PT1菌株发酵滤液中毒杀松材线虫的活性成分。试验结果表明:从7种有机溶剂中筛选出乙酸乙酯(1:3比例)萃取相是PT1菌株活性成分较为合适的萃取溶剂及比例。浸渍法测定结果表明PT1菌株乙酸乙酯(1:3比例)萃取物处理松材线虫24 h和48 h的LC50分别为36.001 μg/mL和26.782 μg/mL。石油醚和正丁醇的混合比例为6:4时,薄层层析展开后有5条带,展开效果最佳,以石油醚-正丁醇6:4作为洗脱液,将高效萃取物经柱层析分离后得到活性组分YZ-4。并用GC-MS分析YZ-4组分,共鉴定出4种化合物,分别为假石榴皮碱、棕榈酸、邻苯二甲酸苯基丁基酯和油酸。活性菌株PT1发酵产物有望研开出新型微生物源杀虫剂。3.马尾松松枝放入到4种化合物溶液、阿维菌素溶液、“CK+虫”及CK组(蒸馏水)中培养,然后向马尾松松枝接种松材线虫液。定期观察松枝的病情指数、蒸腾强度及流脂量。试验结果表明,化合物假石榴皮碱和邻苯二甲酸丁基己酯能够有效的控制松材线虫病情的发展,在处理12 d后,病情指数始终为0.00,与化学药剂阿维菌素处理组病情指数相同,略低于CK处理组的病情指数(0.26);处理后9 d后,马尾松松枝的蒸腾强度和流脂量没有显著改变。而“CK+松材线虫”处理组的蒸腾强度和流脂量显著减少甚至停止。此结果说明,化合物假石榴皮碱和邻苯二甲酸丁基己酯能够有效的抵御松材线虫病的发生发展并且能够维持马尾松松枝正常的生理状态,为松属植物建立了较好的保护屏障。
【图文】：

杀线活性,菌株发酵

图２－３邋ｐＨ对ＰＴ１菌株发酵液杀线活性的影响逡逑２．３．４金属离子对淡紫拟青霉ＰＴ１菌株发酵液稳定性的影响逡逑试验结果显示（见图２－４）：邋Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋与Ｆｅ３＋对ＰＴ１菌株发酵液的杀线活性影响较逡逑大，发酵液对松材线虫的校正死亡率分别下降了约１０％、７％、１２％；而Ｎａ＋和Ｍｇ２＋对逡逑ＰＴ１菌株发酵液杀线活性的影响较小，较原始发酵液杀线活性下降３％左右；Ｃｕ２＋的添逡逑加几乎对发酵液的杀线活性无影响；Ｋ＋使发酵液杀线活性增加了邋２．１％。结果表明淡紫逡逑拟青霉ＰＴ１菌株发酵液对Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋和Ｋ＋均具有较好的稳定性。逡逑１００邋－１逡逑ｆ邋ｓ0－逦ｂ逦ｃ逦１逦ｂ逡逑｜逦，逦ｄ逦ａ逦１逦ａ逦Ｉ逦Ｉ逡逑１邋ｇ逦Ｉ逦ｊ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑ＩＩＭＩＭＩ逡逑ｂｕ邋－１￣邋￣ｉ￣邋￣ｉ￣邋￣ｉ￣￣邋￣￣ｉ￣￣邋邋邋ｉ￣邋￣ｉ￣邋￣：逡逑Ｚｎ２＋邋Ｆｅ２＋邋Ｆｅ３＋邋Ｃｕ２＋邋Ｎａ＋邋Ｍｇ２＋邋Ｋ＋邋对照逡逑图２－４金属离子对ＰＴ１菌株发酵液杀线活性的影响逡逑２．３．５紫外线对淡紫拟青霉ＰＴ１菌株发酵液稳定性的影响逡逑将淡紫拟青霉ＰＴ１菌株发酵液经紫外线照射２、４、８、１２、２４邋ｈ后发现，随着处理逡逑时间的增加，杀线活性与对照相比稍有下降，但变化很小。紫外线照射２４邋ｈ后，与对逡逑照组相比松材线虫校正死亡率下降不到４％

菌株发酵,杀线活性,淡紫拟青霉,紫外线

３逦５邋Ｗ邋１１逦１３邋灥逡逑图２－３邋ｐＨ对ＰＴ１菌株发酵液杀线活性的影响逡逑２．３．４金属离子对淡紫拟青霉ＰＴ１菌株发酵液稳定性的影响逡逑试验结果显示（见图２－４）：邋Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋与Ｆｅ３＋对ＰＴ１菌株发酵液的杀线活性影响较逡逑大，发酵液对松材线虫的校正死亡率分别下降了约１０％、７％、１２％；而Ｎａ＋和Ｍｇ２＋对逡逑ＰＴ１菌株发酵液杀线活性的影响较小，较原始发酵液杀线活性下降３％左右；Ｃｕ２＋的添逡逑加几乎对发酵液的杀线活性无影响；Ｋ＋使发酵液杀线活性增加了邋２．１％。结果表明淡紫逡逑拟青霉ＰＴ１菌株发酵液对Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋和Ｋ＋均具有较好的稳定性。逡逑１００邋－１逡逑ｆ邋ｓ0－逦ｂ逦ｃ逦１逦ｂ逡逑｜逦，逦ｄ逦ａ逦１逦ａ逦Ｉ逦Ｉ逡逑１邋ｇ逦Ｉ逦ｊ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑ＩＩＭＩＭＩ逡逑ｂｕ邋－１￣邋￣ｉ￣邋￣ｉ￣邋￣ｉ￣￣邋￣￣ｉ￣￣邋邋邋ｉ￣邋￣ｉ￣邋￣：逡逑Ｚｎ２＋邋Ｆｅ２＋邋Ｆｅ３＋邋Ｃｕ２＋邋Ｎａ＋邋Ｍｇ２＋邋Ｋ＋邋对照逡逑图２－４金属离子对ＰＴ１菌株发酵液杀线活性的影响逡逑２．３．５紫外线对淡紫拟青霉ＰＴ１菌株发酵液稳定性的影响逡逑将淡紫拟青霉ＰＴ１菌株发酵液经紫外线照射２、４、８、１２、２４邋ｈ后发现，随着处理逡逑时间的增加，，杀线活性与对照相比稍有下降，但变化很小。紫外线照射２４邋ｈ后，与对逡逑照组相比松材线虫校正死亡率下降不到４％，表明淡紫拟青霉ＰＴ１菌株发酵液产生的活逡逑性物质对紫外光有较好的稳定性（见图２－５）。逡逑－１２－逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1

【参考文献】