含透明颤菌血红蛋白基因重组菌的构建及其对菌株发酵产槐糖脂的影响

发布时间：2020-05-20 04:27

【摘要】：槐糖脂是一类由酵母菌产生的生物表面活性剂,与化学工业合成的表面活性剂相比,槐糖脂低毒或无毒,环境相容性好,具有良好的分散、乳化、增溶性能等优点,此外,还具有抗肿瘤、抗病毒、抑制白细胞增长等特点。良好的特性使槐糖脂在日化、石油、环境保护、医药等领域应用日益广泛。目前,限制槐糖脂工业化大规模制备和应用的主要因素是发酵成本过高,其中,发酵过程中氧气的供给和利用水平低导致油溶性底物利用率低、发酵周期长是限制其降低成本的关键因素之一。球拟假丝酵母在利用脂溶性碳源合成槐糖脂的过程中,脂肪酸的羟基化是槐糖脂合成的关键步骤,该反应需要消耗大量氧气,在高密度发酵过程中,菌体细胞生长和槐糖脂合成过程中溶解氧水平往往成限制因素。通过增加通气量、加快搅拌速度、提高罐压等方法改善发酵过程中的溶氧固然可行,但这些措施对设备强度等要求较高,且二氧化碳分压过高还会限制细胞的生长。因此,寻求一种即能增加细胞对氧气的利用效率又不需要大量耗能的手段势在必行。已有研究表明,透明颤菌血红蛋白(VHb)能够从分子水平上提高基因克隆菌对氧气的利用能力,其应用不仅可以降低氧气及能量的消耗,还不需要附加的设备投资,进而大大降低发酵成本。本研究利用现代分子生物学基因重组技术,将透明颤菌血红蛋白基因vgb的编码序列电转化导入球拟假丝酵母O-13-1菌株中,筛选到阳性转化子VHb~+,根据菌体颜色和CO差光谱法验证了VHb蛋白的生物学活性。含VHb基因重组菌的成功构建,为研究VHb对槐糖脂发酵的影响提供了实验材料。透明颤菌血红蛋白基因对槐糖脂发酵生产影响的研究结果显示,摇瓶实验中,重组菌株VHb~+槐糖脂产量高于原始菌株VHb~-;5L发酵罐发酵实验结果显示,在富氧条件(转速400 rpm、通气量1.0 vvm)下,二者的生物量和槐糖脂产量差异不大,但在槐糖脂合成阶段,VHb~+菌株的耗氧量比VHb~-菌株平均低21.8%;在贫氧条件(转速350 rpm、通气量1 vvm)下,VHb~+菌株在发酵过程中对溶氧的利用明显改善,其槐糖脂产量比VHb~-菌株提高了25.1%。采用qPCR方法研究了VHb的作用机理,结果显示,发酵24h时重组菌株VHb~+的TCA循环、呼吸链和槐糖脂合成关键酶基因相对表达水平相差不大,而72h时(槐糖脂生物合成的指数增长期),VHb~+菌株在这三条代谢途径中的关键酶基因表达水平明显增加,表明vgb的表达通过增加TCA循环与呼吸链的活性,提高了细胞内氧气的利用效率,从而促进了槐糖脂的合成。综上所述,VHb基因的异源表达提高了菌株O-13-1对氧气的利用效率,提高了贫氧条件下的槐糖脂产量,是缓解低供氧对其槐糖脂发酵限制的有效方法。本研究通过单次单因素实验方法优化了重组菌株VHb~+的发酵溶氧条件,在转速、通气量和罐压分别为350 rpm、0.6 vvm和0.04 Mpa时有利于槐糖脂的发酵生产,该条件下的槐糖脂产量、生物量及发酵液中的溶氧相对较高,且最终槐糖脂呈透明状粘稠液体,易于通过自然沉降法分离。因此,在工业发酵中,保证发酵液中合适的溶氧,对提高槐糖脂的产量有重要意义。通过透明颤菌血红蛋白基因vgb在球拟假丝酵母O-13-1中的表达,从分子水平上增加了细胞内氧的传递速率,提高了氧的利用效率。这一策略,为解决槐糖脂发酵过程中供氧不足问题提供了一条新的途径,为节能降耗提供依据,具有良好的应用前景。
【图文】：

羟基脂肪酸,内酯,槐糖,泡沫形成

乳化和分散性能。与化学工业合成的表面活性剂相比，槐糖脂作为一种可降解的生物表面活性剂，其生产菌株为非致病菌，与人体和环境有良好的相容性。除此以外，槐糖脂具有良好的分散、乳化、增溶特性等优点，还具有很好的抗肿瘤、抗病毒、抑制白细胞的增长等特点，为生物分子、细胞膜、细胞器以及医用生物制品的研究和使用带来了极大方便，为人类健康作出很大的贡献，具有巨大的研究价值和经济效益。1.1.1 槐糖脂的结构与性质微生物天然合成的槐糖脂是由一系列槐糖脂分子组合成的混合物。这些槐糖脂分子的共同特点都是由亲水性的槐糖(2 个葡萄糖分子以 β-1,2 糖苷键结合)和疏水性饱和或不饱和的长链 ω-(或 ω-1) 羟基脂肪酸两部分共同构成[1]，区别在于它们所含脂肪酸的碳链长度不同、饱和或不饱和的程度不同以及羟基脂肪酸的羟基位置不同，结构的差异使得槐糖脂的理化性质也存在差异[2]。槐糖脂的 2 种类型：内酯型、酸型(见图 1-1)[2]。内酯型槐糖脂抑菌能力较强，可以较好地降低表面张力；而酸型槐糖脂有较好的泡沫形成能力和溶解性[3]。

葡萄糖基转移酶,脂肪酸,羟基化

随着社会环保意识的增强，槐糖脂的研究越来越受种陆续被筛选出来，扩大了原有生物表面活性剂合成菌母 Wickerhamiella domercqiae[4]和毕赤酵母 Pichia anom的一些假丝酵母如 C. batistae、C. riodocensis、C.stellata。此外，在其它不同的属甚至门中也发现了合成槐糖脂的 bogoriensis 就是担子菌属的，，其整体槐糖脂结构类似于肪酸摩尔数不同。本论文所用的槐糖脂产生菌就是球la bombicola）O-13-1 菌株。的合成究发现，产物槐糖脂合成的理论途径大致如图所示（图程主要需要 2 种前体物质: UDP-葡萄糖和脂肪酸。从图的合成先需要进行脂肪酸的羟基化。脂肪酸可以直接从外脂肪酶水解甘油三酯、脂肪酸酯等底物来获得，也可以端氧化的酶，逐步转化烷烃获得。如果培养基中没有疏糖酵解途径，利用乙酰-CoA 从头开始合成脂肪酸。
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.1

【相似文献】