多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成

发布时间：2020-05-20 08:15

【摘要】：D-1,2,4-丁三醇(D-1,2,4-butanetriol,BT)是一种重要的非天然四碳平台化合物,广泛应用于军工、医药、烟草等领域。近年来,研究者对重组大肠杆菌进行敲除分支代谢途径、过表达关键酶及分子伴侣辅助蛋白折叠等改造加强BT合成通路,但产量仍然有限。其中,木糖分支途径缺失不利于生物量积累,低效率的脱羧反应是BT合成的限速步骤。基于此,本研究首先通过筛选高效脱羧酶解除限速步骤,其次分别采用反义RNA技术微调木糖代谢流及弱化葡萄糖效应实现葡萄糖、木糖共底物发酵的策略提高菌体生物量,最后通过培养条件优化实现BT高产。脱羧反应是BT合成途径的限速步骤。为提高脱羧效率,分别从乳酸乳球菌和阴沟肠杆菌基因组中克隆2-酮异戊酸脱羧酶基因kivD及吲哚丙酮酸脱羧酶基因ipdC,并构建重组表达菌株。SDS-PAGE电泳发现重组蛋白表达水平相似。发酵结果显示,携带kivD基因的重组菌株尽管生物量略有降低,但BT产量较对照菌株提高53%,达到1.3 g·L~(-1)。而携带ipdC基因菌株发酵液中并未检测到BT。上述结果表明来自乳酸乳球菌的2-酮异戊酸脱羧酶KivD能高效催化BT合成途径的脱羧反应。为了提高菌株生长能力,采用反义RNA技术微调木糖异构酶表达水平以平衡菌体生长及BT合成。四个反义表达菌株的Xyl A转录水平均受到不同程度抑制,且菌体生物量及BT产量均得到相应提高;BT最高产量达到3.9 g·L~(-1),比对照菌株提高200%。此外,通过对葡萄糖效应相关基因敲除,发现ptsHI、mgsA基因敲除可以有效弱化葡萄糖效应实现葡萄糖、木糖共底物发酵。与出发菌株相比,ptsHI、mgsA双缺菌株生物量提高1.1倍,BT产量提高6.5倍达到6.0 g·L~(-1)。与反义RNA重组表达菌株相比,葡萄糖效应弱化菌株具有明显发酵优势,并将其作为后续研究出发菌株。为进一步提高BT产量,对发酵培养基中葡萄糖、木糖及LB浓度进行优化并通过添加CaCO_3来调节发酵液pH,摇瓶培养重组菌株BT产量提高至12.2 g·L~(-1)。随后对发酵罐培养条件进行优化,在5 L发酵罐中,经分批补料发酵BT产量达到14.9 g·L~(-1)。最后,尝试以蔗渣水解液为底物发酵合成BT,在初始木糖8.4 g·L~(-1)、葡萄糖16.8 g·L~(-1)的蔗渣水解液中重组大肠杆菌展现出较强的发酵性能,BT产量达到3.5 g·L~(-1),摩尔转化率高达84.8%。值得注意的是,本研究的摇瓶发酵及上罐发酵水平均优于已有报道。
【图文】：

丁三醇,分子结构式

2,4-丁三醇的分子结构式g. 1-1 Molecular Structure of 1,2,4-butane为前体物质可用来合成丁三醇三有冲击性小、热稳定性高、挥发军工领域具有广泛应用[1-5]；BTT物的合成[6-10]；BT 作为烟草行业；在彩色显影液中添加 BT 可以三醇主要是化学合成法，商业化生产u-Re，Cu-Al 在高温高压下将苹果酯还原为 BT[14, 15]。此外，，通过对醇(BTD)酸催化法[16]、BTD 氧化路线同样具有工业应用价值[18]。

丁三醇,发酵合成,重组大肠杆菌,D-木糖

图 1-2 重组大肠杆菌以 D-木糖为底物发酵合成 D-1,2,4-丁三醇Fig. 1-2 The synthetic pathway of BT from xylose in E. coli表 1-1 1,2,4-丁三醇生物合成国内外研究水平Table 1-1 The research level of 1,2,4-butanetriol biosynthesis at home and abroad研究机构Institutions研究策略Strategy培养条件CultivationConditionsBT 产量BT titer韩国明治大学构建缺失菌 E. coli W3110 (DE3)ΔxylABΔyagEΔyjhH，利用双质粒分别表达木糖脱氢酶 xdh 基因与苯甲酰甲酸脱羧酶 mdlC 基因，首次获得直接合成 BT 的重组菌LB，10 g·L-1木糖 0.88 g·L-1青岛能源所构建重组表达菌株 E. coli BL21ΔxylAB/pE-mdlCxylBC&pA-adhPyjhG5 L 罐发酵分批补料发酵，木糖添加量 20 g·L-13.92 g·L-1科学院微生物研究所在 E. coli BW25113 敲除 yagE、yjhH、yiaE、ycdW 和 xylAB 基因，筛选高效的 2-酮酸脱以 LB 培养基培养菌体，并在补加 20 g·L-1木糖2.38 g·L-1
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ923

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