类芽孢杆菌甲壳素酶的酶学性质、热稳定性改造及应用研究

发布时间：2020-05-23 04:19

【摘要】：甲壳素是自然界中含量仅次于纤维素的天然多糖,其水解产物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)在功能食品及生物医药领域已有重要应用。传统的酸制备法容易造成一定的环境污染,因此,探索生物法制备甲壳素及其衍生物具有重要意义。甲壳素酶是目前已发现的能在温和条件下专一性将甲壳素水解为水溶性的甲壳寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖的酶,但其在高温条件下热稳定性不好,同时,甲壳素本身致密的晶体结构阻碍了酶分子与底物分子接触,难以进行有效催化。因此,从应用角度出发,探索一种基于甲壳素酶催化的高效制备N-乙酰氨基葡萄糖的反应体系,以取代传统的化学催化工艺,具有重要的环保价值和经济价值。从科学角度出发,理性认识甲壳素酶的分子结构与催化功能之间的构效关系,并进一步通过溶剂工程调控强化酶催化过程,是本研究拟解决的两个关键问题。本研究的主要成果如下:(1)为了解决甲壳素酶来源的问题,从含蟹壳土壤中筛选得到一株高产甲壳素酶的微生物菌株,经细胞形态、生理生化实验及分子生物学鉴定,确定该菌株为一种Paenibacillus pasadenensis,并将其命名为Paenibacillus pasadenensis CS0611。通过对培养基成分进行优化,在以蟹壳粉CSP为唯一碳源的培养基中生长2天后,CSP完全降解,发酵液中甲壳素酶活力可达798.6±16.6 U/L。(2)为了解决野生菌发酵发酵周期长、酶分离纯化操作繁琐等问题,克隆了甲壳素酶基因并将其异源表达于大肠杆菌中。通过基因组测定及分析,Paenibacillus pasadenensis CS0611含有四种甲壳素酶PpChi1、PpChi2、PpChi3和PpChi4,分子量分别为65.4 kDa、45.7 kDa、38.1 kDa和42.4 kDa。构建分别含有4种甲壳素酶基因的重组质粒,实现PpChi1、PpChi2和PpChi4的可溶性表达及分离纯化,三种酶比活力分别为3.34 U/mg、2.96 U/mg和2.22 U/mg。PpChi3的可溶性较差,测得比活力为3.14U/mg。酶学性质表征发现,PpChi1、PpChi2和PpChi4的最适反应温度分别为45 ~oC、55 ~oC和50 ~oC。最适反应pH均为5.0,且在pH 4.0-10.0区间内均保持较好的pH稳定性。不同金属离子对三种重组甲壳素酶的影响不同。SDS对酶的抑制作用极为显著。EDTA、Tween-80和TritonX-100对酶活力无显著影响,表明三种甲壳素酶均不是金属酶。β-巯基乙醇可使Pp Chi1活力降低,而对PpChi2和PpChi4无明显影响,结合3D结构分析,β-巯基乙醇可能会影响PpChi1结构中二硫键(41C-61C,305C-316C)的稳定。PpChi1、PpChi2和PpChi4显示出对甲壳素粉末及胶体甲壳素很高的结合能力。TLC分析发现,以胶体甲壳素为底物时,PpChi1和PpChi2以(GlcNAc)_2为主要终产物,PpChi4以GlcNAc为唯一终产物。PpChi1或PpChi2和PpChi4可以协同水解胶体甲壳素为GlcNAc。(3)针对PpChi1热稳定性差的问题,从PpChi1蛋白质序列及结构出发,对PpChi1进行半理性改造以提高其热稳定性。通过单位点定点突变及组合突变,发现相比于PpChi1,突变体PpChi1-S244C-I319C/T259P(M3)在50 ~oC条件下的半衰期延长了26.3倍,由5.5 min提高至150 min,比活力提高1.3倍。最适反应温度增加7.5 ~oC,最适反应pH仍为5.0,K_m为1.68 mg·mL~(-1),k_(cat)为941.2 min~(-1),V_(max)为13.4μmol·min~(-1)·mg~(-1),催化效率提高49.5%。结构分析及分子动力学模拟表明,该突变体热稳定性的提高主要归因于酶结构刚性的增加。(4)针对催化过程中天然甲壳素结晶度高、水溶性差导致酶解效率低的问题,研究了5种离子液体及3种深度共熔溶剂预处理甲壳素对酶解效率的影响。结果表明,离子液体[BMIm]Ac预处理后甲壳素的酶解效率最高,而深度共熔溶剂预处理效果不明显。利用SEM、FTIR和XRD对离子液体预处理后的甲壳素进行形貌及理化性质表征,结果表明甲壳素经[BMIm]Ac和[EMIm]Ac预处理并再生后,分子内氢键网络发生重排,表面粗糙度增加,结晶度降低,有利于酶与底物的接触,甲壳素的酶解效率得到提高。进一步采用双酶组合的方式水解经[BMIm]Ac预处理的甲壳素,突变体M3+PpChi4与PpChi2+PpChi4两种组合方式得到的GlcNAc的产率分别为786.6±16.5mg/g chitin和640.8±15.1 mg/g chitin。通过改变突变酶M3与PpChi4的添加顺序,GlcNAc的产率进一步提高至864.5±14.5 mg/g chitin。此外,[BMIm]Ac重复使用8批次后,预处理的甲壳素水解为GlcNAc的产率仍为614 mg/g chitin。因此,离子液体预处理可有效提高甲壳素制备N-乙酰氨基葡萄糖的产率,实现甲壳素的最大化利用。
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甲壳素酶

第一章绪论点的-4 位到-1 位区域。糖苷水解酶家族的其他酶通常以酸碱催化的方式例如，蛋清溶菌酶第 35 位的谷氨酸为质子供体，第 52 位的天冬氨酸作够稳定反应中间体。对于甲壳素酶，反应中间体的稳定则通过共价恶唑完成，其中的亲和试剂为底物中的自由 N-乙酰氨基基团。 GH19 甲壳素酶

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图 2-1 产甲壳素酶菌株的分离鉴定流程图-1 The flowchart of screening and identifying the strain producting采集莱州海力生物制品公司，样品采集后置于塑封袋中，封口并做时送回实验室。预处理0.0 g 固体样品于含有 90 mL 生理盐水的 250 mL 三角瓶中，，加下 180 rpm 震荡 20 min，取出静置 15 min，取上清作为液体样分离理的上清液以 4%接种比接入含富集培养基的三角瓶中，37oC稀释后涂布于固体分离培养基中，置于恒温培养箱中 37oC 培
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925

【参考文献】