发酵法生产β-胡萝卜素的产业化关健技术研究

发布时间：2020-05-28 16:10

【摘要】：本研究以β-胡萝卜素产业化为目标,采用低能离子束对三孢布拉氏霉进行注入诱变,结合平板显色反应进行高通量筛选,获得高产菌株,同时完成了对β-胡萝卜素高效液相色谱检测方法的研究,在此基础上,对高产菌株发酵工艺进行深入研究。在采用代谢组学研究基础上,开发了在线监控技术并进行了 12 m3发酵罐的发酵放大生产。随后完成了β-胡萝卜素高效提取及粉剂制备技术的研究,获得了高品质的产品:β-胡萝卜素干菌体、油悬液、晶体及粉剂产品,最终完成了β-胡萝卜素的产业化。首先,对三孢布拉氏霉菌种进行低能离子束注入诱变及高效筛选,得到高产菌株,研究了不同通气量及碳源流加控制策略对该菌株的β-胡萝卜素合成的影响。发现在发酵过程中提高通气量并限制性流加葡萄糖,β-胡萝卜素产量从2.28 g/L提高至3.2 g/L,干菌体中β-胡萝卜素含量(β-carotene/Dry cell weight,BC/DCW)从61.7提高至78.1 mg/g DCW,分别提高了40.4%、26.6%。本文还创造性将正菌和负菌(两种不同生理性状的菌株,需要接合后才能刺激菌种生产β-胡萝卜素)种子液用均质机预处理后接种至发酵培养基中生产β-胡萝卜素。结果表明,β-胡萝卜素产量和BC/DCW分别比对照提高了 29.9%和24.1%。代谢组学研究表明,经均质机处理后的糖酵解途径(磷酸和甘油)和脂肪酸(油酸和亚油酸)相关代谢物与对照明显不同。对葵花籽油和柠檬酸的添加进行了优化,β-胡萝卜素产量和BC/DCW分别比对照提高了40.23%和6.8%。在12m3发酵罐上采用在线均质机对种子液进行预处理并结合混合油和柠檬酸策略性流加方式,β-胡萝卜素产量达到4.48 g/L,此外还尝试了磷酸化二淀粉磷酸酯添加及植酸调控βH,结合半连续培养的方式,可将β-胡萝卜素的产量进一步提升至4.8 g/L,是三孢布拉氏霉研究工艺中报道的最高产量。在高效提取方面,尝试各种不同的提取方式,结果发现:采用复合酶法对发酵菌体进行预处理,随后进行干燥造粒、溶剂萃取,相比常规萃取,β-胡萝卜素提取收率提高了 28.8%。在热溶剂萃取段,使用抗氧化剂可以减少β-胡萝卜素的氧化,进一步提高12%的萃取率;结晶工艺采低温结晶法,相比蒸发结晶更加节能,也减少了晶体长时间受热的损失量,综合收率可以达到80%以上。在产品研究方面,本研究采用喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、包衣及喷雾造粒四种工艺对β-胡萝卜素进行包埋。扫描电镜结果显示包衣工艺最为致密。通过对β-胡萝卜素微胶囊进行6个月的稳定性测试发现,包衣工艺可以最大程度的保留β-胡萝卜素的含量,是最合适的包埋工艺。
【图文】：

２．４．１．１邋Ｐ－胡萝卜素含量检测条件优化逡逑分别以乙酸乙酯－乙腈－水和四氢呋喃－水为流动相体系，比较在不同流动相逡逑中胡萝卜素的响应值以及色谱峰的分离情况。由图２－１与２－２可知乙酸乙酯－乙逡逑腈－水为流动相时胡萝卜素的响应值较高，在１３．１１２邋ｍｉｎ左右出现的峰为胡逡逑萝卜素的色谱峰，，能很好地和溶剂峰、杂质峰分离，故选用乙酸乙酯－乙腈－水逡逑为流动相。逡逑＾４５０逡逑３６０逡逑２７０逡逑Ｉ１８０逦Ｉ逡逑９0邋－邋ＡＩ逡逑０逦１逦ｆ邋逦１逦１逦！逡逑１０逦１５逦２０逦２５逡逑－９０逦时间（ｍｉｎ）逡逑图２＿１逦０－胡萝卜素晶体液相色谱图（四氢呋喃－水）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｌｉｑｕｉｄ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ

于细胞破碎。本实验考察了以下３种方法的的提取效果：①菌体粉碎后直接提逡逑取；②菌体粉碎后使用研抌破壁；③菌体粉碎后使用匀浆器破壁；３种不同提逡逑取方法所得到的乙酸乙酯萃取液中Ｐ－胡萝卜素含量结果见图２－３。逡逑１７逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6

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本文编号：2685494