酸性脂肪酶的高效表达、酶学性质及其应用研究

发布时间：2020-05-29 15:05

【摘要】：酸性脂肪酶是一类在酸性环境中稳定高效地进行油脂水解反应的脂肪酶,在食品、化工、医药、饲料等工业具有良好的应用前景。本课题将来源于黑曲霉Aspergillus niger NICM 1207和土曲霉Aspergillus terreus的两种酸性脂肪酶ANL和ATL在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中实现外源表达,发现ANL存在分泌量低以及ATL存在催化活性低的问题。为实现酸性脂肪酶的高效制备,采用融合表达和定点突变的方式改造脂肪酶。将改造后的重组脂肪酶进行分离纯化与酶学性质的研究,并研究了酸性脂肪酶在胃肠消化模拟实验中的应用。主要结果如下:(1)分别将三种融合标签纤维素结合域(CBD)、麦芽糖结合域蛋白(MBP)和小泛素相关修饰物(SUMO)和ANL进行融合表达,蛋白的表达量均有所提高。其中,与SUMO融合的菌株GS115/pPIC9K-SANL效果最为显著,在摇瓶水平的总蛋白浓度和酶活分别是原始菌的4.31和1.60倍,在3L发酵罐水平的酶活达到960 U·m L~(-1),是原始菌的1.85倍。SUMO融合蛋白(SANL)与ANL同样具有嗜酸特性,即在pH2.5催化活性最高且稳定于pH4.0-10.0。与ANL相比,SANL对橄榄油、三油酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPC_(16))的K_m值分别降低了0.42、0.69和0.15倍,而k_(cat)/K_m值分别提高了1.18、1.79和5.51倍。结果表明融合表达不仅提高了ANL的表达水平而且酶的催化效率也得到了增强。(2)运用理性设计的方法,通过同源比对,选择脂肪酶盖子区域和底物结合口袋域中的位点进行定点突变,得到8种ATL的突变脂肪酶。其中,盖子区域突变酶ATLLid与底物结合口袋域突变酶ATLV218W的催化活性显著提高。ATLLid和ATLV218W对底物对硝基苯酚月桂酸酯(p-NPC_(12))的催化活性最高,k_(cat)值较ATL分别提高了39.37和50.79倍,k_(cat)/K_m值较ATL分别提高了2.85和8.48倍。与ATL相比,ATLLid和ATLV218W的最适pH为5.0,pH4.0-8.0具有较好的稳定性,说明突变未对ATL的嗜酸耐酸特性产生影响,但是突变导致热稳定性略有下降。最后,通过生物信息学分析了ATLLid和ATLV218W催化活性提高的机理。(3)开展了酸性脂肪酶在胃肠消化模拟实验中的应用研究。在胃消化模拟实验中,ANL和SANL对胃蛋白酶pepsin具有很好的耐受性,且在pH3.0-6.0范围内油脂水解活性高、稳定性强,而ATL、ATLLid和ATLV218W对pepsin的耐受性略差,表明黑曲霉脂肪酶在胃消化中更具优势。在肠消化模拟实验中,两类酸性脂肪酶均在4 mmol·L~(-1)NaTDC中受到强烈的抑制作用,导致油脂水解受到限制。将ANL和SANL分别与本研究室的华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶RCL复配进行在胃肠消化模拟环境中的油脂水解反应时,ANL和SANL表现出在胃消化模拟阶段的优势,而RCL可协助酸性脂肪酶在肠消化阶段进一步的油脂水解工作。
【图文】：

流程图,思路,流程图,脂肪酶

图 1-1 主要研究思路流程图Fig. 1-1 Flow chart of main research ideas.1.3.2 课题研究内容(1) 通过文献查阅及搜索 NCBI 数据库，获得 ANL 和 ATL 的基因序列。参照毕赤酵母密码子偏好性进行优化并合成基因，分别构建表达 ANL 和 ATL 的基因工程菌，实现其在毕赤酵母中的异源表达。(2) 通过将蛋白标签与黑曲霉脂肪酶融合，研究融合表达对脂肪酶在毕赤酵母中表达水平的影响。本课题选择 MBP、CBD 和 SUMO 三种融合标签，利用(GGGGS)2作为连接肽，构建与 ANL 的融合的重组表达菌株。通过检测摇瓶发酵过程中菌体浓度、胞外蛋白分泌总量和上清液酶活数据来分析融合表达的影响。(3) 研究融合了 SUMO 标签的黑曲霉脂肪酶融合蛋白 SANL 在 3L 发酵罐中的扩大培养。实时监测诱导发酵过程中菌体浓度 OD600、蛋白浓度，酶活等发酵参数的变化情况。(4) 通过理性设计的方法，在 ATL 的盖子区域和底物结合口袋域中选择突变位点进

标准曲线,标准曲线,染色液,振荡培养

株的菌株生长及蛋白表达的诱导表达在含有 250μg·mL-1G418 的 YPD 平板上划线，30oC 培落，接种至 25 mL BMGY 培养基中，30oC，200 r·min6。6000r·min-1离心 10min，收集菌体并用 100mL 的r·min-1振荡培养 120h，每隔 24h 添加 1%的甲醇诱导表清的蛋白浓度和酶活性。定方法检测利用 Bradford 蛋白浓度试剂盒进行定量[87]。以 5m白标准，，分别用水稀释至不同浓度 0，0.125，0.25，0.μL 不同浓度的蛋白标准液加至 96 孔板中，并在各孔中染色液，混匀且勿产生气泡，用酶标仪在 595 nm 波长线见图 2-1。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925.6

【参考文献】