葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的制备与抗体分离纯化的研究

发布时间：2020-06-03 22:13

【摘要】：近年来,随着上游抗体细胞表达技术的提高和培养规模的扩大,以及抗体药物的高纯度要求和分离纯化工艺的复杂性,蛋白A亲和层析作为下游抗体捕获的平台技术,因价格昂贵、洗脱苛刻、介质利用率低等不足限制了其在抗体大规模分离纯化的应用。短肽仿生亲和层析作为一种新型的抗体分离层析技术,因其低成本、高稳定性、低免疫原性、高选择性和洗脱条件温和等优点,是潜在的蛋白A亲和层析的替代技术,具有良好的应用前景。为了进一步提高短肽仿生层析介质的动态结合载量,引入葡聚糖接枝制备高载量的葡聚糖接枝型短肽亲和层析介质以提高介质对目标蛋白的平衡吸附容量和传质速率是改善介质性能的新途径。本文主要研究了葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的制备及其抗体吸附性能和分离性能,并对比非接枝四肽仿生层析介质的实验结果,分析葡聚糖接枝对短肽仿生层析的影响,为短肽仿生层析介质的改进提供新思路。本文的主要研究内容和取得的结果如下:首先以Ac-YFRH为功能配基,交联葡聚糖琼脂糖基质Bestarose XL为基质,采用HATU法制备了不同配基密度的葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质Ac-YFRH-XL,考察了介质对hIgG、BSA和Fc融合蛋白的静态吸附性能。实验结果表明Ac-YFRH-XL介质对hIgG的吸附是疏水相互作用和静电相互作用共同主导,在pH 9.0时吸附容量可达133 mg/g介质,在pH 5.0无吸附,同时对氯化钠和辛酸钠表现出较好的耐盐性。Ac-YFRH-XL介质对BS A的吸附主要基于静电相互作用,在pH 5.0时非特异性吸附最高。相同配基密度的Ac-YFRH-XL介质对Fc融合蛋白比hIgG有更高的吸附容量和结合能力,符合前期基于配基和抗体Fc片段间主要结合位点的计算机模拟结果。引入葡聚糖接枝可以增加介质的配基偶联密度从而提高其对抗体的吸附容量和结合能力,较非接枝四肽层析介质有优势。接着考察了葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质Ac-YFRH-XL对hIgG和BSA的动态吸附性能。结果表明介质在pH9.0时对hIgG的动态结合载量(Q10%)可达36.8mg/mL,约2.5倍于非接枝Ac-YFRH-4FF介质的14.9 mg/mL,同时该条件下介质对BSA无吸附。Ac-YFRH-XL介质在低盐条件(NaC1≤0.2 M)下对抗体有较好的结合能力,高盐条件下几乎无吸附,耐盐性弱于非接枝层析介质。此外,在高于非接枝介质的最大偶联密度的一定配基密度范围内,葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介质对抗体的结合载量随之增加,显著增加了介质在更大规模分离中的应用潜力。最后探究了葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介质对实际料液体系的分离性能。在pH9.0条件下从混合蛋白(hIgG:BSA=1:4)体系中分离hIgG得到抗体的纯度和收率分别为98.7%和89%;在pH9.0条件下从CHO培养上清液中分离单抗得到单抗纯度和收率分别为93.0%和84.7%,相较于非接枝Ac-YFRH-4FF介质具有相似的分离效率,但葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介质能达到更高的处理量,显示了其在更大规模体系中的分离潜力。
【图文】：

（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，，ＩｇＧ）作为主要的血清抗体组成部分，其比例高达７５？８０°／0［１４］。逡逑１．２．１抗体的结构逡逑如图１．１所示，抗体本身由两条完全相同的重链（Ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ，Ｈ链）和两逡逑条相同的轻链（Ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ，邋Ｌ链）通过四对二硫键相连且呈现Ｙ字型的基本结逡逑构。ＩｇＧ的分子量约为１５０邋ｋＤａ，其中两条重链约为５０邋ｋＤａ，两条轻链约为２５逡逑ｋＤａ［１５，１６］。ＩｇＧ的可变区位于重链和轻链的Ｎ端，该区域氨基酸序列变化较大，逡逑在重链和轻链所占的比例分别为２５％和５０％；邋ＩｇＧ的恒定区则位于氨基酸序列更逡逑稳定的Ｃ端，一般分为ＣＨＩ，邋ＣＨ２和ＣＨ３。在ＣＨ１与ＣＨ２之间存在铰链区，逡逑２逡逑

邋＾邋ｕ逡逑Ｃ端逡逑图１．１邋ＩｇＧ的结构示意图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩｇＧ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑１．２．２抗体的应用逡逑抗体因其独特的生物活性而被广泛应用于生物技术领域和临床医疗领域，其逡逑主要的生物活性特点包括：（１）抗原特异性结合：在机体内特异性结合外源毒素逡逑或病毒，介导免疫应答反应，促使抗体抗原复合物被巨噬细胞吞噬；（２）激活补逡逑体？．激活补体的经典途径可以通过ＩｇＧ的构型变化所暴露出的ＣＨ２／ＣＨ３的相关逡逑３逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ464;O658.1

【参考文献】

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本文编号：2695471